[发明专利]经修饰的细胞因子的纯化

说明书

技术领域

本发明涉及从异构体混合物中分离达贝泊汀(darbepoetin)的低pI异构体的方法。

背景技术

促红细胞生成素或EPO是糖基化的细胞因子，其由肝和肾细胞产生，并且调节红细胞的产生。纯化的重组人EPO可给病人服用，以治疗与红细胞供给缺乏相关的疾病，例如贫血和慢性肾衰竭。

人EPO分子的多肽骨架具有不变的氨基酸序列；然而，糖侧链在含糖量和结构方面呈现出微观不均一性(Sasaki H等人，J.Biol.Chem.，1987；262：12059-76，Rush RS等人，Anal.Chem.，1995；67：1442-52和Rush RS等人，Anal.Chem.，1993；65：1834-42)。带负电荷的唾液酸分子通常将糖链的每一个臂的末端封闭。因此，糖链的可变性质(整体上)和唾液酸的含量(特别地)会产生带有不同电荷的EPO异构体(Rush RS等人，Anal.Chem.，1995；67：1442-52)。Egrie及其同事(Egrie JC.和Browne JK.，Br.J.Cancer，2001；84，3-10和Egrie等人，Glycoconj.J.，1993；10：263-269)发现了rHuEPO的糖部分上的唾液酸基团数量与其血清半衰期及生物活性之间的直接联系。具有更多唾液酸残基的促红细胞生成素异构体显示出更强的生物活性，因为唾液酸残基会阻止在体内的快速清除。

达贝泊汀是新的红细胞生成促进蛋白或具有五个N-连接的糖链和多至22个唾液酸的EPO类似物。相反，重组人EPO具有三个N-连接的糖链和最多14个唾液酸(Egrie JC.和Browne JK.，Br.J.Cancer，2001；84，3-10和Elliot S等人，Blood，2000；96：8 2a)。由于额外的糖基化，达贝泊汀相对于重组人EPO显示出长三倍的血清半衰期和增加的体内活性。达贝泊汀的异构体的产生主要是由于它们的糖基含量不同以及带负电荷的末端唾液酸残基的数量不同。具有更高唾液酸含量的异构体具有低pI。这些具有低pI的达贝泊汀的异构体已被证明具有更高的治疗价值，例如Amgen Corporation的以ARANESP形式销售的产品。

文献公开了通过单独使用阴离子交换色谱或使用阴离子交换色谱与疏水相互作用或排阻色谱技术的组合来纯化EPO及其类似物。

国际申请公布号WO 00/27869公开了促红细胞生成素的纯化方法，其由以下顺序的步骤组成：疏水相互作用、阴离子交换、阳离子交换和排阻色谱步骤。国际申请公布号WO 03/045996公开了通过反相色谱、阴离子交换和排阻色谱的重组人促红细胞生成素的色谱纯化。Gokana等人，Journal of Chromatography，第701卷，1997，109-118页，描述了通过DEAE-Sephacel色谱的重组人促红细胞生成素异构体的色谱分离方法。

因此，上述公开具有一系列复杂的色谱步骤，用于促红细胞生成素及其类似物的纯化。然而，需要用于从异构体混合物中分离达贝泊汀的低pI异构体的简单而有效的方法。

发明内容

本发明的一些方面提供了分离达贝泊汀的异构体的方法。在一些实施方案中，所述方法用于达贝泊汀的低pI异构体的分离。在一些具体的实施方案中，所述方法用于pI为约4.5或更小的异构体的分离。

异构体的分离或纯化使用至少一个在流通模式(flow-through mode)下的阳离子交换色谱步骤来完成。所述方法使用一定范围的pH和盐浓度，以从达贝泊汀异构体的混合物中分离低pI异构体。

一方面，本发明提供了从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低pI异构体的方法，所述方法包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤。

一方面，本发明提供了从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低pI异构体的方法，所述方法包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤且进一步包括至少一个阴离子交换色谱步骤。

一方面，本发明提供了从达贝泊汀异构体的混合物中分离达贝泊汀的低pI异构体的方法，所述方法包括至少一个在流通模式下的阳离子交换色谱步骤和进一步包括至少一个混合模式交换色谱步骤。

附图说明

图1是实施例6的实验中得到的等电聚焦凝胶，其显示了实施例5中描述的Q琼脂糖凝胶步骤的洗脱液中得到的低pI异构体。

图2是实施例6的实验中得到的等电聚焦凝胶，其显示了如实施例4中所述进行的CM-琼脂糖凝胶步骤的流通液(flow-through)中得到的低pI异构体。

具体实施方式