[发明专利]控制多肽修饰反应的方法

说明书

发明领域

本发明涉及控制多肽修饰反应的方法，特别(但并非排他的)是控制人因子VII(FVII)活化以产生人因子VII(a)(FVII(a))的方法。本发明也涉及通过所述多肽修饰反应可获得的多肽以及涉及包含所述多肽的药物组合物。

发明背景

血液凝固是由各种血液成分(或因子)复杂的相互作用组成的过程，该过程最终引起纤维蛋白凝块。一般来说，参与被称为凝血“级联”的血液成分是无酶活性蛋白(酶原)，这些蛋白通过活化剂(本身是活化凝血因子)的作用转化为蛋白水解酶。已经过上述转化作用的凝血因子一般称为“活性因子”，并且其通过在凝血因子的名称添加字母“a”来命名(例如因子VII(a))。

FVII(也称作单链FVII、未活化FVII或酶原)是单多肽链，其在Arg152和Ile153间的肽键被蛋白酶切割之后即转化为活化型-FVII(a)。所述反应可通过FVII(a)自体蛋白酶解或通过其它酶例如FXa或罗素蝰蛇毒(Russel viper venom)催化。自体活化具有的好处就是不需要添加酶或在反应后物理移除酶。

能够小心控制FVII的活化是很重要的，因为一旦活化比例达到大于99％(即一旦优选底物Arg 152已被耗尽)，则重链降解产物(AA290和AA315)的含量会显著增加。因此避免过度活化产物是至关重要的。同时，高比例的活化(例如高于94％)是理想的，这留下相当狭窄的区间(例如94-99％)，在该区间内可获得低降解产物含量及高活性两者。

一定量的酶活化会在该酶纯化期间同时发生。此外，由于起始材料组合物(主要是FVII(a))效价变异以及所引起柱负荷的差异，纯化过程期间的活化水平将不可避免地变化。纯化期间意外的保存时间也会引起活化水平变化。纯化期间，FVII(a)分子会经历浓度、pH及停留时间方面的各种条件，所述条件会导致部分活化。纯化之后，业已发现活化的比例随纯化技术及条件的变化而有很大变化(例如16％至74％)。纯化后活化比例的差异，产生有关纯化后进行标准化活化程序的重要问题。

FVII的活化比例可通过已知程序计算；但是目前没有实时测量技术，而且已知程序的持续时间通常为大约30分钟。因此，如果在取样测量时活化比例接近99％，那么当得到结果时将超过该值。这将会导致高水平的不想要的重链降解产物。

US 4,286,056(Baxter Travenol Lab)描述了用以产生活化的凝血酶原复合物浓缩物的方法，所述方法包括通过测定起始材料的活化状态，然后根据对起始材料活化进展的分析改变至少一种活化条件以达到预设的活化水平，从而控制活化程度。WO 2007/013993(Maxygen Holdings Ltd)描述了一种用于在溶液中将FVII活化为FVII(a)的方法，所述方法包括：添加胺类化合物、Ca²⁺，调整溶液的终浓度至大约7.2到8.6，将所得到的活化混合物在大约2℃到大约25℃之间保温足以将至少90％的scFVII转化为FVII(a)的一段时间。US 4,456,591(Baxter Travenol Lab)描述了向有凝血因子缺陷(例如凝血因子不足或有凝血因子抑制剂)的患者给予有效止血量的组合物的方法，其中唯一有效的活化止血剂为因子VII(a)。

因此非常需要提供一种用于确定最适反应时间以提供所需水平的修饰酶的改良方法。

本发明也提供较纯的蛋白酶产物。较纯的蛋白酶产物导致患者体内抗蛋白酶(抗体)形成的可能性较小。

此外，蛋白酶活化率的严格控制最终导致生产工厂里废料减少，因为当更大数目的批料符合规定要求(就纯度和质量平均度而言)时将会丢弃更少生产批料。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供一种控制多肽修饰反应的方法，所述方法包括计算至少一种方法变量以及应用所述变量于数学模型中以便计算进一步方法变量值的步骤。

根据本发明的第二方面，提供一种进行多肽修饰反应的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)测量多肽的起始浓度；

(b)测量经修饰多肽的起始比例；

(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中计算的值与经修饰多肽所需比例值相互关联，计算多肽修饰反应时间；及

(d)以步骤(c)计算的时间进行多肽修饰反应。

根据本发明的第三方面，提供一种根据上文定义的方法可得到的多肽。

附图简述

图1图解说明本发明的总体构思。对于变化的输入值，该方法确保输出值是基本可预测及恒定的。