[发明专利]甘蓝型油菜BnGLABRA2启动子及制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离的启动子，其序列为SEQ ID NO：1所示的基因启动子。

2.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜GL2启动子GP2的制备方法，其步骤是：

A、基因组步移克隆启动子序列：

利用SDS裂解法提取基因组DNA，按照基因组步移试剂盒操作程序，进行基因组步移，每次步移扩增两轮PCR克隆油菜，具体步骤为：提取基因组DNA 25μL，分别用核酸内切酶Dra I、EcoR I、Pvu II和Stu I酶切，纯化后加入接头形成四个不同的基因组DNA库，用作首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守序列设计特异性引物GSP1与试剂盒内上游接头引物AP1进行扩增，第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液为模板，设计引物GSP2和接头引物AP2进行扩增，进行第二轮基因组步移，所有PCR反应均为50μL扩增体系：模板1μL，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，LA Taq酶1.25U，10×LA-PCR buffer5μL，补水至50μL，反应条件均为：94℃预变性1min；98℃10s，72℃6min 7个循环；98℃10s，67℃6min33个循环；72延伸10min，PCR产物经1.0％质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，GelExtraction Kit纯化回收后，连接到pMD18-T载体，转化gold感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列；

B、启动子序列生物信息学分析：

将所克隆序列用BLASTN进行同源比对，启动子核心元件和上游顺式作用元件用启动子预测软件进行预测，得到核心启动子序列和上游启动子元件；

C、全长启动子、缺失启动子的扩增以及pMD18-T-GP载体的构建：

以基因组DNA为模板，根据得到的启动子序列，设计扩增各缺失片段的引物进行PCR扩增，所有引物的5′端含有Hind III酶切位点，3′端含有Xba I酶切位点，反应体系为25μL内含：1×PCR buffer.，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，设置循环参数，PCR产物1.0％质量体积比琼脂糖凝胶检测，回收试剂盒回收各目的缺失片段，按各回收的缺失片段∶载体＝3∶1的比例混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，1×反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml，16℃过夜连接反应，冻融法转化大肠杆菌gold菌感受态细胞中，涂布于含有Amp的LB固体平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含Amp 50μg/mL的液体LB培养基，37℃ 200r/min振荡培养过夜，小量碱法提取质粒，Hind III/Xba I酶切质粒1μg，0.8％质量体积比琼脂糖凝胶检测，检测正确的阳性重组克隆，为pMD18-X，以M13F/M13R为引物M13 R5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；M13R5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’，将pMD18-X进行序列测定，得到了一种甘蓝型油菜BnGL2基因全长启动子。

3.权利要求书1中所述一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1在根部中的应用。

4.权利要求书1中所述一种甘蓝型油菜BnGL2基因部分缺失启动子SEQ ID NO：1在整个叶脉中的应用。

5.权利要求书1中所述甘蓝型油菜BnGL2基因缺失启动子SEQ ID NO：1在叶片表皮毛中的应用。

6.权利要求书1中所述甘蓝型油菜BnGL2基因缺失启动子SEQ ID NO：1在中柱叶脉中的应用。