[发明专利]基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳及其工作方法

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物用膜片钳技术领域，特别是指一种基于扫描纳米玻璃探针显微镜技术的探测活体细胞膜表面离子通道活性的高分辨率膜片钳技术，即一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳及其工作方法。

(二)背景技术：

电生理学的产生与发展从一开始就与电子仪器的革新与进步紧密相连，仪器设备灵敏度和分辨率的提高为深入探知生物电本质创造了条件。1976年德国马普研究所的Erwin Neher和Bert Sakmann博士创建膜片钳技术(patch-clamptechniques)以来，它给电生理学和细胞生物学的发展乃至整个生物学研究带来了一场革命，人们因此对离子通道本质的认识有了一个质的飞跃。这一伟大的贡献使Neher和Sakmann获得了1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。膜片钳技术的发展对离子通道的功能及细胞功能的调控研究起到了巨大的推动作用，其为阐明离子通道病的发病机理并探索治疗的新途径提供了有效的研究方法。然而，任何技术与方法都不是尽善尽美的，膜片钳技术自发明伊始就从未停止过被改进和完善。根据特定的试验条件又发展出了多种模式的膜片钳技术，从而保证了该技术可用于多种细胞功能的研究。现在，每年都有数千篇膜片钳技术方法及其应用方面的文献报道，该技术在生物学领域里的广泛应用已成为现代生物学的主要内容之一。大量的膜片钳技术研究结果表明：大量的膜片钳技术研究结果表明：细胞膜的离子通道并不是均一分布的，而是通常分布在细胞表面的微观结构中，离子通道的这种分布方式与细胞生理功能紧密相连。如具有保钠排钾功能的肾上皮细胞，其特异性咪吡嗪敏感的上皮细胞Na⁺通道和电压敏感型K⁺通道多分布在约100纳米大小的微绒毛上。离子通道与细胞表面亚细胞微观结构及其生理功能紧密相关的现实，向传统的膜片钳技术发起了新的挑战。传统的膜片钳技术须先借助光学显微镜来在细胞膜表面进行玻璃微电极针尖定位后再进行离子通道的记录，由于光学衍射极限的限制使普通光学显微镜的最高分辨率很难突破200纳米，导致传统的膜片钳技术不能准确研究离子通道与小于200纳米的细胞表面微结构的关系。加之，许多生物样品的光透过性不好，这更加降低了传统膜片钳技术的分辨率。因此，低分辨率的传统膜片钳技术已不能满足目前生物学研究的需要。

随着纳米技术的飞速发展及扫描探针显微镜技术(SPM)在生物领域的广泛应用，使高分辨率地实时探测活体生物样品成为可能。1989年，加州大学的Hansma教授利用扫描探针显微镜的负反馈控制技术，用玻璃微探针作为扫描探针设计出了非接触式的扫描离子电导显微镜技术(scanning ion conductance microscopy，SICM)(见图1)。但是由于当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足，纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常意外地与样品表面接触并导致针尖或样品的毁损，所以扫描离子电导显微镜技术在其发明后的很长一段时间仅适用于平坦的PET薄膜的扫描成像。1997年英国伦敦帝国理工学院的Korchev教授对扫描离子电导探针显微镜的负反馈控制等技术进行重大改进后，使该显微镜技术实现了对活体生物样品表面结构的非接触三维实时探测，并逐步成为纳米生物医学研究领域具有发展潜力及应用前景的一种扫描纳米玻璃探针显微镜技术。SICM可以实时高分辨率地非接触式探测活体生物样品表面形貌，其纳米尺度玻璃微滴管扫描探针与膜片钳用玻璃微电极相似且同样在电解液中工作，因此为建立高分辨率的膜片钳技术提供了技术保障。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳及其工作方法，它针对传统膜片钳技术分辨率的不足，提供了一种利用扫描探针显微镜非接触式扫描的高分辨率来精确定位膜片钳玻璃微滴管电极，建立了一种基于非接触扫描探针显微镜扫描控制技术的高分辨率膜片钳技术，从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定生理功能(离子通道特性)的关系提供了全新技术手段。