[发明专利]一种改良的重组卡介苗

说明书

技术领域

本发明属生物与新医药技术(医药生物技术)领域。

背景技术

卡介苗(bacillus calmette querin，BCG)是预防结核病的唯一疫苗，但其免疫保护效果不 稳定，对成人结核的预防作用为0-80％。各国学者正致力于更加高效、安全的结核病疫苗的 研究。将外源基因引入BCG，并使外源DNA在BCG中持续稳定表达即重组BCG，是目前 研制新型结核病疫苗的热点。重组BCG的效果理想与否取决于向其引入的外源基因的性质， 以及外源DNA的表达效率。大量研究表明，结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A及早期分泌性 靶抗原6(Early secretory antigen target 6，ESAT6)均为结核杆菌的主要分泌抗原，可诱导较 强的免疫应答。采用单独ESAT6或Ag85A重组BCG，免疫动物后发现其免疫保护作用不及 BCG，其原因可能是其抗原刺激不足，另外一方面可能是其载体的表达效率较低。穿梭表达 质粒pMV361具有卡那霉素抗性基因、大肠杆菌-分枝杆菌的复制起始点及MTB HSP60的启 动子。另外，它还有黏附位点attP及整合基因int，借此，可以定向地整合到BCG基因组的 染色体attB上，从而有别于一般的穿梭载体，从而更加准确、持久地表达插入BCG的目的 蛋白。本研究采用结核分枝杆菌Ag85A及ESAT6为引入基因，以准确稳定表达的穿梭质粒 pMV361为载体，构建重组质粒，并将此质粒导入BCG，构建重组BCG。

发明内容

1.重组质粒pMV361-Ag85A-ESAT6的构建及鉴定

根据Genbank中报道的基因序列设计及合成2对引物，以结核杆菌H37RV基因组DNA (结核杆菌H37RV基因组DNA由本室保存)为模板，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增结核分枝杆菌Ag85A及早期分泌靶抗原6(ESAT6)基因。分别向Ag85A 下游及ESAT6上游引入45个碱基的linker、两端引入Mun I及NspV酶切位点，通过SOE 法(重叠延伸，Gene splicing by overlap extension)，扩增Ag85A-ESAT6融合基因，胶回收试 剂盒回收目的基因。质粒提取试剂盒提取pMV361空质粒(pMV361空质粒由四川大学徐恒 教授惠赠，本室常规保存)，琼脂糖凝胶电泳显示质粒提取效果佳。限制性核酸内切酶Mun I 及NspV分别双酶切融合基因Ag85A-ESAT6及pMV361空质粒，酶切后胶回收试剂盒回收目 的基因。按融合基因Ag85A-ESAT6与pMV361空质粒的摩尔比8∶1的比例进行连接，连接 试剂盒16℃条件下连接4h后，直接转化感受态大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆提取质粒， 分别采用Mun I及NspV双酶切、PCR扩增进行鉴定，鉴定正确质粒送Invitrogen公司进行测 序鉴定。经上述3种方法鉴定后证实此重组质粒构建成功，并命名为pMV361-Ag85A-ESAT6。

2.重组卡介苗rBCG-Ag85A-ESAT6构建及鉴定

卡介苗转种培养制备感受态细胞，将上述构建成功的pMV361-Ag85A-ESAT6质粒纯化后 经电穿孔法转化感受BCG细胞，命名为rBCG-Ag85A-ESAT6。电穿孔放电完毕后，取菌液 涂布于含卡那霉素的平板上，37℃静置3～4周，然后挑取平板上单菌接种于液体培养基继续 抗生素筛选。待菌膜长出，细菌基因组提取试剂盒提取重组卡介苗基因组，以重组卡介苗基 因组为模板进行PCR鉴定。经PCR鉴定成功的基因组送Invitrogen公司测序以证明导入卡介 苗的目的基因未发生突变或缺失等。与此同时，相同方法将pMV361空质粒导入BCG作为 对照，命名为rBCG-361。

3.目的基因在重组卡介苗中的诱导表达及鉴定

经抗生素筛选、PCR鉴定以及基因组测序证明构建成功的重组卡介苗静置培养数周待菌 膜长出后，热诱导1h，收集培养液上清，装入透析袋浓缩至原体积1/10。将诱导表达后的菌 体超声破菌，收集破菌上清及沉淀。采用单克隆抗体对此3种收集物进行Western-blotting鉴 定，以证明重组卡介苗是否表达目的基因及其表达量，研究中以BCG及rBCG-361为对照。