[发明专利]生物酶不对称转化生产D-苯丙氨酸的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程领域中的酶工程技术，本发明涉及一种以DL-苯丙氨酸为原料，利用L-苯丙氨酸解氨酶作为催化剂，不对称转化其中的L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸和氨，而D-苯丙氨酸完全不参与反应，作为产物提取出来。

技术背景：

氨基酸类生化产品是关系到人类生命健康的主要物质，用途广泛。近年来D-苯丙氨酸在食品医药方面的用途被充分的开发，尤其在医药领域，国际上许多公司用D-苯丙氨酸为原料开发了一系列抗肿瘤药(百士欣，奥曲肽等)，2型糖尿病治疗药物(那格列奈)，抗艾滋病药物(茚地那韦)等等。D-苯丙氨酸在世界范围内需求量也急剧上涨。

已知制取D-苯丙氨酸的方法主要有“氨基酰化酶法”，“不对称化学转换法”，“海因酶法”。其中，“氨基酰化酶法”是目前生产D型氨基酸常规方法，在生产其他D型氨基酸上也应用广泛，但因为氨基酰化酶价格昂贵，只能用于小规模的生产。“不对称化学转化”反应机制太复杂，工艺流程长，且需要昂贵的纯手性试剂作为拆分剂，生产成本高。目前国内外工业化生产D-苯丙氨酸普遍采用“海因酶法”，该法需要两种酶催化剂的参与，底物浓度低，转化时间长，转化率低，产品纯度不高，而且成本很高。目前国内外企业工业化生产D-苯丙氨酸的方法均有，规模小，产率低，成本高等缺点。无法应对世界范围对D-苯丙氨酸日益增长的需求。

世界各国在手性药物的研发的投入，对D-苯丙氨酸的需求量的增加，迫切需要研究开发一种适合大规模工业化生产的，能显著降低生产成本的技术。依据生物酶的不对称降解或转化原理，研究生产手性氨基酸的方法，是一个重要的方向，本项目的技术创新就是基于该原理。

发明内容：

本发明要解决的问题是：提供一种原料易得，生产过程简单，条件温和，能够大幅度降低生产成本的D-苯丙氨酸生物酶不对称转化生产的方法。

其技术方案是：一种D-苯丙氨酸生物酶不对称转化生产方法，具体步骤和特征如下：

1.含酶细胞悬液的制作：

采用摇瓶或发酵罐通风培养。摇瓶旋转速度为40-200转/分钟，1000毫升三角烧瓶装液量100-400毫升，培养时间12～48小时，培养温度25℃-40℃。发酵培养通风比1∶0.05V-1∶0.4V(液体体积：每分钟通入空气体积)。

培养基可以使用通常的碳水化合物作为碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麦芽汁、糖蜜等；作为氮源可以单独或混合使用各种动物植物蛋白胨、豆饼水解液、硫酸铵、酵母提取物、玉米浆等；无机盐可以单独或混合使用氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等多种无机盐；诱导物为单独或者混合使用的L-苯丙氨酸，DL-苯丙氨酸，L-酪氨酸；酶稳定剂为单独或者混合使用的聚乙二醇、山梨醇、戊二醛、甘油、谷氨酸。此外培养基中加入大豆油、各种消泡剂，避免灭菌或培养过程中的起泡现象。培养基配制后用酸或碱调节PH值到4.0-7.5。然后用蒸汽110-121℃灭菌10-30分钟。

其中碳源浓度为0-100g/L；氮源浓度为0.5-50g/L，无机盐的浓度为0.1-10.0g/L。诱导物浓度为0-1.0g/L，酶稳定剂的浓度为0-1.0g/L。

本发明使用的是产L-苯丙氨酸解氨酶微生物，主要是红酵母属，如深红酵母，粘红酵母等，也包括链霉菌属，枝孢霉属，曲霉属等。通过培养这些微生物得到含酶的微生物的细胞悬液，可以直接加入底物反应，也可以将微生物细胞或者L-苯丙氨酸解氨酶单独分离提取出来使用。也可以将分离得到微生物细胞用聚合胶包埋等方式固定化使用。

2.酶不对称转化反应

将培养好的细胞悬液(发酵液)维持一定的温度25℃-55℃，向液体中加入底物DL-苯丙氨酸，加入的DL-苯丙氨酸两种异构体的比例任意。反应体系中的L-苯丙氨酸解氨酶特异性的催化转化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸和氨。其中的D-苯丙氨酸完全不参加反应。反应过程检测反式肉桂酸浓度，检测反应体系pH值，随着反应的进行反应液pH值会增加，可以通过加入硫酸控制反应体系的pH值，维持最适宜的pH值在4.0～10.0.

3.产物提取分离

反应过程D-苯丙氨酸浓度增加，积累到一定程度，D-苯丙氨酸从反应体系中结晶出来，通过离心分离就可以得到粗品。

分离溶解在反应体系的D-苯丙氨酸，可以通过向酶液中加酸调节酶液pH在1.0到5.0，利用肉桂酸在酸性环境下不溶于水的特性，沉淀除去反式肉桂酸，然后浓缩结晶提取。

4.D-苯丙氨酸的精制