[发明专利]重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，特别涉及基于质谱技术的用于对重度妊娠高血压生物样品中生化标记物分析的试剂盒制备方法，从复杂生物样品中富集和纯化重度妊娠高血压中的新型生化标记物。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行鉴定分析。用质谱联合可克服这一技术缺点。

妊娠高血压疾病妊娠是特有的，表现为妊娠20周后出现血压升高、尿蛋白及全身各脏器功能紊乱的疾病综合征。重度子痫前期的发病率：3-5％，是引起围产期母儿不良妊娠结局的主要疾病之一。近年来的新研究方法包括：蛋白组学、基因组学、脂质组学、mRNA微阵列技术等，从分子学水平，深入研究妊娠高血压疾病的发病机制，有望找到妊娠高血压疾病特异生化指标，成为早期诊断、监测病情及判断疾病预后的依据。蛋白质组学是研究基因组在不同时间和空间编码的全部蛋白质的组成及作用规律，在组织细胞的整体蛋白质水平上揭示生命活动的基本规律，获得对细胞生理、病理过程及调控网络的全面而深入的认识。应用的技术平台主要有二维凝胶电泳分离技术和质谱分析技术。前者主要用于分子量10-100kD蛋白质分离，对于疏水性、低丰度、低含量的蛋白质难以检出。而质谱仪可实现10kD以下小分子、低含量，尤其是组织细胞内的微量调控蛋白质的分离鉴定。蛋白质指纹图谱技术是一种新的蛋白质分离、鉴定方法。其原理是：利用激光脉冲辐射使蛋白质芯片池中的分析物解吸形成荷电离子，不同质荷比的离子在仪器场中飞行的时间长短不一，经软件处理后，精确的绘制出蛋白质谱图。其优点是：可直接从原始样品中进行捕获、检测与分析，灵敏度高，检测范围广(500～500000)，所需样品体积小(0.5～400μL)；检测简便，整个测定过程一般为30min，且敏感性和特异性高；同时不会破坏所测定的蛋白质；结果可靠，可重复性高。该技术不仅可筛选出与疾病相关的特异生物标志物，还可发现与疾病相关的不同方式组合的蛋白质指纹图谱，为疾病的临床早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后提供了依据。

目前在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于重度妊娠高血压生化标记物检测的标准化质谱试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测临床重度妊娠高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为重度妊娠高血压的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的重度妊娠高血压生物标志提供了基础。

本发明提出的用于检测重度妊娠高血压生物标志的质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管粘合液，10～30μl；

一小管质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；

一小管MB-WCX磁珠或金属亲和表面(MB-IMAC Fe)磁珠30～50μl；

一小管清洗液300～500μl，该清洗液为50～100mM PBS或NaAc，pH值为4.0～5.0；

[清洗液pH值为3.0～6.0时，蛋白指纹检测发现，pH值为4.0～5.0清洗液时蛋白指纹检测最好(蛋白峰最多)]。

一小管洗提液10～50μl，该洗提液为1～5％三氟乙酸的水溶液；

一小管稳定剂5～10μl，该稳定剂由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏盒中。

本发明提出的上述质谱试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)含粘合液的质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在粘合液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，加10％牛胰岛素(bovine insulin，5733Da)，并将该稀释的血清(浆)分装成10～30μl小管中；其中，血清(浆)∶粘合液＝1∶2，所述粘合液为9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0～9.0；

2)将购买的50～100mM PBS(Phosphate-Buffered Saline)或NaAc，pH值为4.0～5.0清洗液、1～5％三氟乙酸的洗提液分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；