[发明专利]用于检测膜上活细胞的包含NOG、HMP、氯化铷和/或氯化锂的细胞透化组合物

说明书

本发明涉及一种用于细胞透化的新型组合物，其包含N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NOG)、多聚磷酸钠(HMP)和选自氯化铷和氯化锂的盐的组合，该组合物可籍荧光标记物标记细胞，同时保存所述细胞的活力。 

本发明还涉及一种检测和/或鉴定滤膜上液体或气体样品所含的活细胞的方法。 

本发明特别适合于进入例如食品或药品生产链的液体和气体介质的微生物质量控制。 

在该领域内，污染物可能以稀释在大量水或气体中的各种细胞形式存在，尤其是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 

但仅检测这些细胞是不够的，还有必要对它们进行精确鉴定，确保它们是介质中的活细胞，而不是在其使用前可能对空气或水进行处理所造成的死细胞。例如，使用氯或臭氧进行水处理可导致介质中细胞死亡，这些细胞可被肉眼检测到，不会成为污染源。 

现有技术中描述了许多检测方法，用于检测一定时间内滤膜上的液体或气体介质中的活细胞的存在。这些方法一般包括： 

-通过滤膜过滤所述液体或气体介质的步骤； 

-将与营养介质接触的所述膜与温育数小时的步骤，在此期间过滤后仍存留在滤膜上的细胞发生分裂，形成肉眼不可见的微集落；以及 

-采用各种发光或荧光技术检测形成微集落的细胞克隆的步骤。 

例如WO 01/59157描述了这种方法。该方法已被用于开发检测活细胞的通用试剂盒，名为“Milliflex Rapid”(Millipore)。在该方法中，检测细胞的步骤由裂解滤膜上过滤后和温育后的细胞组成，裂解的目的在于释放细胞的三磷酸腺苷(ATP)成分。释放的ATP被用作鉴定和定量活细胞(ATP-生物发光)的标记物，它充当可产生化学发光反应的酶(荧光素酶)的底物。该化学发光反应产生光信号，光信号被视频接口(CCD照相机)俘获，随后以合成图像的形式储存。该合成图像可原位显现膜上微生物显影的地方，所采用的 方式与在培养皿上的琼脂培养基中进行的常规计数类似。 

该技术具有可检测所有活细胞的优点，因为ATP是所有活生物体内大量存在的分子。因此它能可靠地指示受试样品中存在的污染物数目。 

另一方面，提取ATP需要裂解，因此需要杀死细胞，无法随后培养微生物进行鉴定，即确定微生物的种。 

因此关于污染所获得的信息只是定量而非定性。 

专利申请FR 2289984描述了另一种检测膜上细胞的方法。在该方法中，使用特异杂交探针检测存留在滤膜上的细胞。采用聚乙烯亚胺(PEI)和乙醇的透化组合物，可使检测探针透过细胞壁，一旦这些探针进入细胞，所述探针与细胞内的基因组RNA或DNA序列发生特异杂交。这些探针一般为多聚核苷酸，经选择可与核酸特异杂交，以靶向污染物的一个或多个种。洗涤步骤后采用照相机检测标记有荧光剂或发光剂的探针，以定位滤膜上的细胞。 

这种检测方法特异性虽然更高，但无法明确区分活细胞与死细胞。事实上，探针在活细胞和死细胞内均发生杂交，因此会导致假阳性。此外，即便透化组合物通常可保持细胞壁的完整性，但该方法的各个步骤却不能保持细胞是活着的，尤其是由于将细胞固定在纤维素膜上的步骤。 

申请WO 2004/050902描述了另一种膜上检测的系统，它可检测污染血液样品的微生物的存在。设计该方法旨在避免微生物的裂解。该系统的特点在于过滤前使标记剂渗透进入微生物，进行微生物的检测，而此时微生物仍处于液体介质中。就这点而言，在膜上进行过滤和检测细胞之前，使用包含标记剂和透化剂的透化溶液稀释待测液体样品。 

使用的标记剂为小分子，尤其是DNA嵌入化合物，例如花菁衍生物、碘化丙啶、吖啶橙或溴化乙锭。利用本领域技术人员知晓的透化剂例如聚乙烯亚胺(PEI)、毛地黄皂苷、nonensin、多粘菌素或苯扎氯铵的作用，这些化合物相对容易地渗透通过微生物的壁。所述嵌入剂在DNA转录或复制时附着到核酸内部，即只发生在样品所含的活细胞中。 

该方法可标记所有活细胞，同时能保存细胞活力。但是，细胞在膜过滤前在液体介质中被标记，这会引起最终得到的计数结果不可靠。事实上，如果标记细胞时液相中的细胞正在分裂，膜上检测到的细胞数目可能是最初存在细胞数目的两倍。而且，透化和标记组合物对液体样品的稀释会导 致最终结果出现显著的误差容限，该误差容限随着成功检测所需的流体操作引入的偶然污染的概率而增加。