[发明专利]一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法

权利要求书

1.一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，其特征在于：分为亮甲酚 蓝染色筛选及培养的步骤；

其一，摘取宰杀后半小时内的绵羊卵巢，置入温度30-40℃，含1000IU/ml 青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其清洗3-4次，在显微镜 下捡出卵母细胞；添加浓度为25-30μMol/L的亮甲酚蓝染色液，置于35-39℃ 水浴中染色85-92分钟，待细胞质呈蓝色时，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30 枚/滴，放入前2小时平衡好的体积为55-78μl/滴的体外成熟液中，放入CO₂箱，在5％CO₂、95％的空气条件下培养；

其二，将体外成熟25-28小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理 30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/ 滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的体外受精液滴内；水浴解冻精液， 移入前2小时平衡好的装有体外受精液的试管，放入CO₂箱，上游20-25分钟， 取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液；将剩余的精子沉淀， 按2-4×10⁶个/ml的密度加入体外受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；

其三，将受精12-18小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，经吹吸， 脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入 平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养，即完成体外受精筛选及培养；

试剂的配制：

吸卵液：TCM199-hepes十1mg/mlPVA十0.7mg/ml肝素钠；

亮甲酚蓝染色液：PBS+26μMol/L亮甲酚蓝+5mg/mlBSA；

体外成熟液：TCM199-HCO₃十10％FBS十0.05IU/ml FSH十0.05IU/ml LH十 1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；

SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH₂PO₄+0.6ul/ml乳 酸钠+0.089mg/mlMgSO₄+2.1mg/mlNaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸钠 +0.299mg/mlCaCL₂·2H₂O；

体外受精液：SOF+20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；其 中，采发情羊的静脉血，放置4℃冰箱内冷却24小时，将析出的血清，在56℃ 水浴锅内灭活30-33分钟，即得发情羊血清；

体外培养液：SOF+3mg/mlBSA。

2.按照权利要求1所述的筛选培养方法，其特征在于：在抽取卵母细胞前， 先吸入1-1.5毫升吸卵液备用。

3.按照权利要求1所述的筛选培养方法，其特征在于：筛选卵母细胞，细 胞质着蓝色为阳性组，缩写为BCB+；不着蓝色的为阴性组，缩写为BCB-。