[发明专利]一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及山茶花组织培养方法，属于生物技术领域，是一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法。

背景技术

山茶花(Camellia)是世界著名的观赏木本花卉，其栽培历史悠久。常用的无性繁殖方法是扦插、分株和嫁接，由于山茶花是一种生长比较缓慢的植物，特别是一些名贵和优良品种，育性较差，种质资源缺乏，扦插时生根率极低，繁殖系数低，远远不能满足市场需要。因此利用组织培养技术快速、大量繁殖山茶花优良品种具有重要意义。此外，近年来发展起来的植物基因遗传转化技术突飞猛进，山茶花的组织培养为该方向的发展奠定了基础。在组织培养中器官发生途径成苗较快，但生根较难，且遗传稳定性较差，而胚状体成苗途径中胚状体具有两极性结构，利用这一途径进行无性繁殖，繁殖速度快，遗传稳定性高，能克服器官发生途径生根难的问题。另外，诱导胚状体成苗，通过胚性细胞克隆，人工种子工厂化生产、突变体诱导筛选、种质资源保存和利用均具有重要意义。国内外在红山茶、云南山茶花、油茶等山茶属植物的体细胞胚状体诱导有过报道，但再生率都较低，阻碍了下一步工作进展。

发明内容

本发明的目的是针对山茶花组织培养再生植株困难的技术瓶颈，提供一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：这种山茶未成熟胚再生胚状体的方法，该方法按以下步骤进行：

(1)将山茶花未成熟果子用自来水冲洗干净，再用洗衣粉浸泡10分钟，自来水冲洗；然后转移到无菌超净台上去除果皮后，用体积比为75％乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍，用重量比为0.1％的HgCl₂中浸泡15——20分钟，无菌水冲洗5——6遍；

(2)将种子剥去内外种皮，去除胚根和胚芽，将子叶切成薄片，接种在胚状体诱导培养基上，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为12h/d，胚状体诱导培养基为MS+1.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA；

(3)将诱导的子叶形胚状体从母体上分离下来，接种在胚状体生长培养基上，胚状体生长培养基为MS+0.16-BA mg·L^-1+0.01NAA mg·L^-1+40g·L^-1sugar，在苗高1-2厘米时移至1/2MS培养基上。

本发明的有益效果是：本发明培养基配方简单，操作工艺简便，培养时间短，再生频率高，成本低，有利于大规模生产山茶及实现外源基因的遗传转化。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例：这种山茶未成熟胚再生胚状体的方法，材料为浙江红山茶8月未成熟果实。将采集的果实用自来水冲洗干净，再用洗衣粉浸泡10分钟，自来水冲洗。然后转移到无菌超净台上去除果皮后，用体积比为75％乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍，用重量比为0.1％的HgCl₂中浸泡15——20分钟，无菌水冲洗5——6遍。无菌条件下剥去种子外层种壳及内层种皮，取出具有两旁肥厚子叶的成熟种胚，子叶切成薄片，接种在胚状体诱导培养基上，培养基为MS+1.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA+40g·L^-1sugar。培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为12h/d。切成薄片的子叶在培养基上培养3天后，一些子叶开始变绿，一周后子叶表面凹凸不平，3-4周后表面形成乳黄色的颗粒状突起，在光照条件下慢慢变绿，40天以后小颗粒长成具有2片子叶状的胚状体。其再生频率达55％以上。

将胚状体从母体上分离下来，接种在胚状体生长培养基上，培养基为MS+0.16-BAmg·L^-1+0.01NAA mg·L^-1+40g·L^-1sugar。在其上生长一周后，胚状体开始两极生长，两片叶子慢慢张大，根向下钻入培养基，并有很多须根长出。生长1周后苗高1-2厘米，移至1/2MS培养基上，苗可健壮生长，半月后小植株长至3-5厘米高，已有多片叶子，温室条件下锻炼一周左右，移栽入土。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。