[发明专利]肝素、胶原材料和生长因子的交联物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，特别涉及肝素、胶原材料和生长因子的交联物及其制备方法。

背景技术

组织工程被视为对治疗组织缺陷的一项很有希望的技术，但是关于组织材料(如胶原材料)的一个主要问题就是：它们不能在有效合理的时间内形成血管化。血管再生是发育，组织再生及创伤修复的基础，是创伤修复及缺血性疾病治疗的一个重要方面。因此，为了促进血管再生的进程，在治疗创伤修复时将血管诱导因子与组织材料联合应用。

碱性成纤维生长因子(bFGF)是一种有效的促细胞分裂素，也是血管内皮细胞的调节器，可促进血管内皮细胞的增殖和迁移，这些都是血管再生的重要方面。据报道，含胶原结合区的bFGF与胶原膜结合后有效的促进了血管再生。但是，bFGF在注入体内后很容易随体液流失，从而导致效用的降低，并且在周围组织中引起副作用。

脱钙骨基质(Demineralized bone matrix，DBM)是一种非常好的生物适合的胶原骨架，是一种很有前途的生物材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备肝素、胶原材料和生长因子的交联物的方法。

所述方法包括以下步骤：

1)将肝素与胶原材料交联，得到肝素与胶原材料的交联体；

2)将生长因子与步骤1)中得到的交联体混合，孵育，得到肝素、胶原材料和生长因子的交联物。

上述步骤1)中将肝素与胶原材料交联的方法包括如下步骤：将肝素溶液与所述胶原材料混合，反应；所述反应的温度为30-40℃，优选为37℃，反应的时间为3-5小时，优选为4小时。

上述步骤2)中所述孵育的温度为30-40℃，优选37℃；所述孵育的时间为0.5-1.5小时，优选为1小时。

所述胶原材料为脱钙骨基质或酸性胶原；生长因子为具有肝素结合域的生长因子，所述生长因子优选为碱性成纤维生长因子。

本发明的另一目的在于提供一种由肝素、胶原材料和生长因子制备的交联物。

所述交联物中肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为(0.2-0.4)∶(800-1200)∶(0.07-0.12)，优选的质量比为0.31∶1000∶0.092。

该交联物是按照上述方法制备得到的。

本发明的另一目的在于提供肝素在促进生长因子和胶原材料结合中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)将肝素与胶原材料交联，得到肝素与胶原材料的交联体；

2)将生长因子与步骤1)中得到的交联体混合，孵育，得到肝素、胶原材料和生长因子的交联物。

所述步骤1)中将肝素与胶原材料交联的方法包括如下步骤：将肝素溶液与所述胶原材料混合，反应；所述反应的温度为30-40℃，优选为37℃，反应的时间3-5小时，优选为4小时。

所述步骤2)中所述孵育的温度为30-40℃，优选37℃；所述孵育的时间为0.5-1.5小时，优选为1小时。

所述胶原材料为脱钙骨基质或酸性胶原；生长因子为具有肝素结合域的生长因子，所述生长因子优选为碱性成纤维生长因子。

本发明的又一目的在于提供上述交联物在制备促进血管再生的修复材料中的应用。

本发明通过肝素使更多的生长因子与胶原材料牢固结合，得到三种物质的交联物，实验证明，用相同浓度的bFGF在相同条件下进行实验，结合了肝素的DBM(HC-DBM)要比未结合肝素的DBM结合更多的bFGF，且差异显著，表明肝素(HC)增强了生长因子bFGF对胶原材料DBM的特异结合，阻止了生长因子的扩散。

本发明得到的肝素、生长因子与胶原材料的交联物的生物活性更高，细胞增殖实验证明，在hc-collagen/bFGF上细胞的生长速度要比在collagen/bFGF和collagen/PBS上快的多，细胞数量差异很显著；体内血管化实验证明，用本发明的HC-DBM/bFGF交联物包埋，组织中生成的血管数目明显多于DBM/PBS、DBM/bFGF，而且随着时间的增长，血管数目不会因为生长因子的流失而减少，相反能在bFGF的诱导下，诱导更多的内皮细胞迁移增殖，从而诱导更多的血管再生。另外，本发明的交联物的制备方法操作简单、成本低廉。因此，本发明的方法及交联物在组织修复中将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为bFGF与DBM和HC-DBM的结合曲线图。

图2为成纤维细胞在collagen/PBS，collagen/bFGF和HC-collagen/bFGF上增殖情况。

图3为皮下包埋7天时，待测材料的外形图以及免疫组织化后的图片。