[发明专利]产生抗AMP-18单克隆抗体杂交瘤、抗AMP-18单克隆抗体及其在胃癌检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫化学、肿瘤生物学和细胞生物学领域。具体而言，本发明的目的在于制备一种与人体胃正常粘膜所分泌的天然胃窦粘膜分泌蛋白-AMP-18(Antrum mucosal protein-18)，相结合的单克隆抗体的杂交瘤；由该杂交瘤产生的抗AMP-18单克隆抗体及其相应产品可应用于人胃癌的诊断试剂或相关领域。

技术背景

胃癌是严重危害人群健康最常见的肿瘤之一。其发病率和致死率仅列于肺癌之后，位居癌症死因的次位。目前，世界上治疗肿瘤的主要方法是手术、放疗、化疗和生物治疗等四种。从医学角度看，至今肿瘤的治疗没有一种完全有效的手段，尤其是已经发生转移的肿瘤患者，传统的治疗方法无法控制肿瘤的全身扩散。研究证实，肿瘤直径与手术后5年生存率密切相关，肿瘤直径＜2cm，5年生存率100％，肿瘤直径每增加1cm，5年生存率下降20％。所以早期诊断，甚至在原位癌阶段诊断对于提高癌症治愈率极具重要意义。

随着分子生物学的发展，肿瘤标志物得到了广泛的重视和应用。它的出现，使人们对肿瘤的早期诊断寄予了极大的希望。肿瘤标志物(tumormarker，TM)是指在肿瘤的发生和发展过程中，由肿瘤细胞本身或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的与正常机体显著不同的一类物质，它们既可能是蛋白质或核酸分子，也可以是糖类或脂类分子。肿瘤患者血液或体液中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有较高应用价值。

AMP-18是一个新近发现的由胃腺体上皮细胞合成的自分泌蛋白质，分子量约为18kDa。该蛋白专一地表达于胃粘膜，而在人体其他组织中没有或极低表达。根据本实验室的前期研究和其他文献报道，我们发现AMP-18与胃癌的发生和发展有密切关系，其主要特征为，1)AMP-18的表达程度与胃粘膜上皮细胞分化正相关，即分化较低时，AMP-18的表达量很低，甚至不可检，反之，当细胞分化程度较高时，AMP-18的表达水平接近于正常；2)AMP-18在肿瘤细胞或肿瘤组织中表达下调或缺失，而在正常组织中呈高表达；3)胃幽门螺旋杆菌感染是导致胃癌的重要原因之一，而AMP-18的表达量与患者体内的幽门螺旋杆菌量呈正相关；4)AMP-18的表达与胃癌病人的预后正相关。综上所述，AMP-18可以作为分子标志物应用于胃癌的临床诊断和预后疗效的评估。由于AMP-18的高分泌特征，在正常的胃组织粘膜层可以检测到它的存在；但是，在胃癌发生的区域，AMP-18随着癌症的进程而显著下降，因此，一种高特异性和灵敏度的AMP-18抗体是生产临床诊断试剂所必需的。

本发明通过原核表达该蛋白，免疫Balb/c小鼠并经过融合、克隆筛选、制备腹水、亲和层析技术纯化腹水获得了鼠源单克隆抗体。免疫组化实验检测胃癌配对组织中的表达的实验可见AMP-18在正常组织中高表达，但在胃癌组织中低表达或不表达。免疫印迹实验检测八对胃癌组织中及六种胃癌细胞系中AMP-18的表达情况的实验显示：在所有的八对胃癌和癌旁组织中，AMP-18在正常组织中全部高表达，在肿瘤组织中基本不表达。另外，我们仅能在正常胃黏膜细胞系GES中检测到AMP-18的表达，而在6种胃癌细胞系中MP-18的表达均为阴性。免疫荧光定位外源AMP-18的实验显示：AMP-18是细胞的一个自分泌蛋白质，这就意味着AMP-18可以分泌入血，及可能在胃组织粘膜或血清中检测到AMP-18的存在。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能专一性针对AMP-18的单克隆抗体杂交瘤及其制备方法，以及这种抗AMP-18单克隆抗体杂交瘤分泌的抗体在肿瘤检测中的用途；提供一种特异性好的单克隆抗体的方法，该抗体的亚类为IgG2a，能特异结合AMP-18重组抗原和天然抗原；提供一种可以用于实验室或临床诊断肿瘤组织AMP-18表达水平的免疫诊断试剂或检测试剂。