[发明专利]流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)，前者通过检疫扑杀患病牛、羊、猪等动物为措施，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患病动物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健康，阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。

根据现在国际上及我国的使用来看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱毒活疫苗，但S19的毒力强，接种母畜易引起流产，利用血清学方法不能与野生菌株感染区分；而RB51的毒力相对较弱，虽然能够进行血清学的鉴别诊断，但RB51的免疫效力备受争议，在我国也没有使用。所以安全标记疫苗菌株是现在世界各国对于布鲁氏菌病防控的技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用。

本发明提供的重组菌株，是将流产布鲁氏菌疫苗菌株S19(Brucella abortus)S19中的葡萄糖基转移酶基因灭活得到的菌株。

所述流产布鲁氏菌菌株S19为现有流产布鲁氏菌疫苗株。

所述葡萄糖基转移酶可为任何来源于流产布鲁氏菌菌株(Brucella abortus)的葡萄糖基转移酶，具体可如序列表的序列1所示。

所述葡萄糖基转移酶的编码序列具体可如序列表的序列2所示。

可通过任何现有方法灭活所述葡萄糖基转移酶基因，如基因组中该序列缺失、外源或内源序列插入、同源重组、RNA干扰等。

所述同源重组可通过将DNA片段DA6导入所述流产布鲁氏菌菌株S19实现；所述DNA片段DA6自上游至下游依次为同源臂DA6-1和同源臂DA6-2；所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2能与所述菌株基因组中的葡萄糖基转移酶编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述葡萄糖基转移酶。

所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2的长度均为400-600bp。

所述同源臂DA6-1具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO359(上游引物)：5’-GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3’(序列表的序列3)；

pWUO360(下游引物)：5’-AAGCTTCGCCTCGGTACTTAACTGG-3’(序列表的序列4)。

所述同源臂DA6-2具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO361(上游引物)：5’-AGGCGAAGCTTGGGCAGGGGCATGAATA-3’(序列表的序列5)；

pWUO362(下游引物)：5’-CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3’(序列表的序列6)。

实验证明，该重组菌的毒力低于出发的母本菌株，免疫保护效力与现有疫苗株相当，并且具有临床检疫、诊断用免疫标记。因此，该重组菌可用于制备布鲁氏菌疫苗。

所述重组菌株可应用于制备流产布鲁氏菌病疫苗。

本发明还保护一种流产布鲁氏菌病疫苗，它的活性成为所述的重组菌株。

本发明通过对流产布鲁氏菌疫苗菌株S19基因组中的功能基因进行筛选，发现葡萄糖基转移酶编码基因的灭活可以改变菌株免疫动物血清中的抗体组成，接种动物不产生脂多糖抗体。本发明通过将流产布鲁氏菌疫苗菌株S19的葡萄糖基转移酶基因灭活，得到了新的重组菌株，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，与出发菌株相比，该重组菌株的毒力较小，而且可使免疫接种动物和临床患病动物通过血清学技术进行鉴别。使用本发明的菌株免疫小鼠，小鼠体内能够产生与标准菌株、现有疫苗菌株不同的免疫反应状态，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明可应用于布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，应用于开发布鲁氏菌病疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。

附图说明

图1为DA6-1和DA6-2的PCR扩增电泳图。

图2为DA6的PCR扩增电泳图。

图3为pEX18AP-DA6转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增的鉴定图。