[发明专利]一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用。

背景技术

甘露聚糖是一种重要的植物半纤维素，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状 多聚体，具有高吸水性。饲料中所含的甘露聚糖在单胃动物的消化道内大量吸水， 使食糜的粘度增加，从而对胃肠的蠕动产生抵抗作用，直接影响了动物对营养物质 的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在饲粮中的广泛应用，甘露聚糖 的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途 径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、α- 半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-甘露聚糖酶编码基因。

本发明所提供的β-甘露聚糖酶编码基因可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第7-1020位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码β-甘露聚糖酶 的DNA分子；

4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码β-甘露聚糖酶的DNA分子。

序列表中的序列1由1026个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第 7-1020位碱基，编码β-甘露聚糖酶。

所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如GenBank Accession No.ACH41133.1所示。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃ 条件下杂交并洗膜。

扩增上述β-甘露聚糖酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的 保护范围。

含有上述β-甘露聚糖酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组 菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为在毕赤酵母表达载体pPICzαA的多克隆位点间插入上述 β-甘露聚糖酶编码基因得到的重组载体，如pPIC-mann。

所述重组菌具体可为在毕赤酵母X-33中导入含有上述β-甘露聚糖酶编码基因 的重组表达载体得到的重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种制备β-甘露聚糖酶的方法。

本发明所提供的制备β-甘露聚糖酶的方法，是发酵培养上述含有β-甘露聚糖 酶编码基因的重组菌，得到β-甘露聚糖酶。

上述重组菌可用于制备猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂，以提高饲料的利用率。

本发明通过基因工程技术，利用枯草芽孢杆菌MA139的β-甘露聚糖酶的氨基 酸序列(GenBank Accession No.ACH41133.1)和毕赤酵母的密码子偏好性，合成了一 个β-甘露聚糖酶编码基因，并将其转入毕赤酵母中，从而能高效生产β-甘露聚糖 酶。发酵实验结果表明，利用本发明方法生产β-甘露聚糖酶，10升发酵罐中β- 甘露聚糖酶的平均酶活达到2100U/mL，该β-甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃， 最适催化pH为6.0，适合作为猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂使用。

附图说明

图1为重组菌发酵过程曲线

图2为β-甘露聚糖酶的最适催化温度

图3为β-甘露聚糖酶的最适催化pH值

图4为重组菌的SDS-PAGE结果

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、β-甘露聚糖酶编码基因的获得

根据已报道的枯草芽孢杆菌MA139的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.ACH41133.1)和毕赤酵母的密码子偏好性，优化设计了β-甘露聚糖酶 的编码基因序列，在该序列的5′末端和3′末端分别添加限制性内切酶EcoRI和XbaI 的酶切位点，人工合成β-甘露聚糖酶的编码基因序列。合成的β-甘露聚糖酶编码 基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列合成由上海生工生物工程 有限公司完成。