[发明专利]人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神经元的方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神经元的方 法。

背景技术

人羊膜组织是胚胎发育的早期产物，形成于原肠胚之前的受精第8天，人羊膜上皮细 胞主要由外胚层的成人羊膜细胞和滋养层细胞等构成，近年的研究证实培养人羊膜上皮细 胞可以合成分泌神经营养因子(Neurotrophic-3 NT-3)、脑源性神经营养因子 (Brain-derived neurotrophic factor BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor NGF)，可释放乙酰胆碱和儿茶酚胺等神经介质，认为人羊膜组织的主要作用之一是向羊水 提供神经营养因子，确认了其在早期神经系统发育中的神经营养作用^[12]。人羊膜上皮细胞 条件培养基与含有睫状神经营养因子、N2和B27的培养基相比较，可以明显提高视网膜神 经节细胞的成活率，考虑人羊膜上皮细胞可能分泌合成一种未知的生物活性物质，具有神 经保护作用，对胚胎早期神经系统的发育具有调控作用^[13]。Marvin等从分子水平证实了人 羊膜组织表达神经营养因子基因，如ephrin-A2，ephrin受体-A2、-B1、-B3、-B4和-B5， neuropilin-2，p75等神经生长因子受体和semaphorin-F^[18]，这些基因在胚胎发育成熟的不同 阶段具有重要作用。因此神经发育生物学研究认为，神经发生的早期人羊膜组织直接与神 经上皮联系，向羊水中释放神经递质及神经营养因子，在神经系统发育过程中起着重要作 用。特别是近年文献报道人羊膜上皮细胞可以移植胶质细胞分化，促进神经元分化，我们 的实验证实，人羊膜上皮细胞表达多巴胺能表型分化相关基因：Math1、NGN2；以及神经 发生相关基因：Mash1、Noth1，hAEC-NSC体外复合培养80％以上向神经元细胞分化，胶 质细胞分化紧1-5％。

基于上述理论我们开展并建立了“人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴 胺能神经元的方法”的实验体系。

发明内容

本申请的发明目的在于提供人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神 经元的方法。

本申请的发明内容通过以下的方法进行实施：

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方 法，该方法包括以下步骤：

(a)将人羊膜上皮细胞种植在复合培养板的上层培养室内的半透膜上，神经干细胞球 放置在复合培养板的下层培养室内，上层培养室在下层培养室的上方，上层培养室和下层 培养室之间装有半透膜装置，其中充满微孔，复合培养板内充满了神经干细胞基础培养基， 人羊膜上皮细胞分泌的生长因子透过半透膜装置进入到放置神经干细胞球的下层培养室 中；

(b)将上述复合培养板放置在二氧化碳孵育箱内培养10-15天；

(c)移走上层培养室，去除放置在下层培养室内的神经干细胞球、未贴壁细胞和神经干 细胞基础培养基；

(d)对收获的部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析， 得到了含有多巴胺能神经元样细胞的细胞；

(e)收获上述所有细胞。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方 法，其中：所述人羊膜上皮细胞的个数与神经干细胞球的个数比为10～100∶1。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方 法，其中：所述复合培养板是在温度为37℃、湿度为95％和5％的二氧化碳的孵育箱内进 行培养的。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方 法，其中：所述步骤(c)中的定量分析是利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后 在倒置生物显微镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方 法，其中：所述每毫升的神经干细胞基础培养基含有：15％的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、100ng的成纤维细胞生长因子8、10ng的碱性成纤维细胞生长因子8、200μM的维 生素C和20ng的脑源性神经营养因子。