[发明专利]中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列、构建方法及其氨基酸序列和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国林蛙功能序列及其编码的蛋白序列，具体地说是一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列及其编码的氨基酸序列和其用途。

背景技术

全世界每年新诊断的癌症病例达1亿，每10万人中250人死于癌症，因此战胜癌症是现代医药最重大的挑战之一。尽管外科手术可以治愈可切除的癌症，不可切除的癌症只能采用化学治疗或放射治疗。常规药物用于治疗存在的主要问题是，缺乏选择性，毒性强烈及外来蛋白的免疫原性，经常会导致副反应，如暂时性腹泻、恶心、脱发、易感染。有时会对心、肺、肾、骨髓产生长期影响。

大多数降解DNA的药物所导致的凋亡与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否关系密切，在p53缺失的情况下，降解DNA的药物对肿瘤无效。目前人类的大部分肿瘤(尤其是实质性肿瘤)都能通过变异使p53失活，或产生p53抗体。而且，导致DNA损伤的药物往往能够使正常细胞产生基因变异。

因此需要开发毒性适度的、人类具有免疫耐受性的药物来解决这些问题。

RNases能够降解RNA引起细胞死亡，被认为是一种毒素。活细胞大约含有20种外切和内切核糖核酸酶，把RNA处理为成熟形式并调控RNA转录。RNase参与RNA代谢、细胞成熟、细胞生理死亡、促进血管生成，而且发挥抵御RNA病毒的宿主防御功能。

当外源RNases进入细胞，它们可能通过降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋亡而杀死细胞。

实际上，已经发现多种核糖核酸酶在体外实验中具有细胞毒性，但在体内实验中却毫无毒性。该家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase A)，由于受到哺乳动物体内普遍存在的核糖核酸酶抑制剂(RI)的作用，不具备抗肿瘤作用。而从牛精液中发现的天然二聚体形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，尽管与RNase A的氨基酸序列相似性高达80％，但是不受RI的抑制作用，在体内外实验中均显示出强大的选择性地抗肿瘤作用。BS-RNase不仅作用于肿瘤细胞，还具有胚胎毒性，精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是来源于嗜酸性粒细胞的核糖核酸酶A超家族成员，尽管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病毒功能，而ECP主要表现出强大的杀菌、杀寄生虫的功能。从家鸡(Gallus gallus)白细胞中分离到两种核糖核酸酶RNases A-1和A-2，二者具有81％氨基酸序列相同，二者都与人血浆核糖核酸酶抑制剂(hRI)相互作用。RNases A-2同时具有血管生成活性和杀菌作用，RNases A-1没有这两种活性。目前的研究发现，核糖核酸酶A超家族成员是一组快速进化的蛋白家族，不同的物种中核糖核酸酶序列的微小差异导致功能的显著变化。

目前文献报道的蛙类核糖核酸酶抗肿瘤的研究，仅局限于豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。不同蛙物种核糖核酸酶的氨基酸序列不同，结构的差异导致功能不同。

在两栖动物蛙属中，最早被鉴定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt等从R.pipiens卵中基于其抗肿瘤作用而分离的蛋白。Onconase完整氨基酸顺序的阐明，揭示出其属于核糖核酸酶A超家族。另外三种核糖核酸酶从蛙的卵和肝被鉴定：牛蛙Rana catesbeiana(蛙卵rc-RNase，蛙肝rc-L1)日本稻田蛙Ranajaponica(蛙卵rj-lec)。1998年Huang等首先分离出编码蛙核糖核酸酶的cDNA，发现mRNA仅在雌蛙的肝脏表达，最终合成的蛋白定位于蛙卵细胞中。2000年Liao等从蛙卵黄颗粒提取物和肝中分离出5个编码牛蛙R.catesbeiana核糖核酸酶的cDNA序列(rc-01编码rc-L1，rc-02，rc-03，rc-04，rc-06)，2000年Chen等从r.pipiens中发现了性别特异性的细胞毒性核糖核酸酶(rp-rap)。2001年Rosenberg等以牛蛙Rana catesbeiana基因组DNA为模板，采用PCR得到了五个新的蛙核糖核酸酶基因顺序(rc-203，rc-204，rc-208，rc-212，rc-218)。表明来源于蛙属的核糖核酸酶基因通过正向选择快速分化的方式进化，暗示了这个独特的蛋白家族可能具有新的生理功能。

以核糖核酸酶A为代表的大多数嘧啶碱基特异性核糖核酸酶具有四个分子内的二硫键，而且其位置非常保守。蛙蛋白保留了核糖核酸酶A四个二硫键中的三个，在靠近C端出现一个新的二硫键。尽管与RNase A具有相似的三维结构，来源于两栖动物的RNases在体外实验中不受人RI抑制，这归因于其与RNase A的序列相似性低。进化地位更低的鱼类却受到RI抑制。