[发明专利]一种HIV-1整合酶表达菌株及整合酶抑制剂体外筛选模型

说明书

【技术领域】：本发明属于基因工程技术领域。本发明利用基因工程构建可溶性整合酶表达载 体和带有整合酶底物LTR序列的质粒，用纯化的整合酶作用于底物质粒，加入样品即可测定样品 对整合酶活性的影响。此检测模型克服了已有ELISA检测法成本高，本底高，影响因素多等缺点， 可在体外大量而快速的对各种天然或化学合成的整合酶抑制剂进行初步筛选。

【背景技术】：人类获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS， 又称艾滋病)是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的。艾滋病是一种 具有较高传染率的疾病，全球HIV感染和死亡人数居高不下。目前尚没有治疗爱滋病的有效方法。 整合酶是HIV-1感染至发病过程中的关键酶，而且在人体中没有其同源类似物，因此抑制整合酶 的药物对人体的副作用相对较小。整合酶作为抗HIV的新靶点，近年来受到各研究者的关注。

随着研究的不断深入，新型整合酶抑制剂不断涌现，但是相比其它抗HIV-1药物，整合酶抑 制剂的研究进展缓慢，这很大程度上是因为整合酶药物筛选模型的缺乏。大量抗HIV-1药物的快 速筛选、活性的研究、作用机理的阐明都需要高效、可靠的检测模型。目前，还没有理想的艾滋 病动物模型，而且动物模型往往具有成本高，周期长，实验结果不稳定以及难以大规模筛选药物 等缺点，抗艾滋病药物的筛选主要还是依赖于体外筛选模型。

目前，对于HIV-1整合酶体外药物筛选方法主要是放射自显影法及改良ELISA法。这两种方 法都有很多缺点而得不到广泛应用。放射性自显影法中用到的放射性元素对实验操作者具有一定 的危害并且易对环境造成污染；改良的ELISA法对实验人员操作技术要求较高，实验结果不稳定， 反应本底、假阳性率高和成本都较高。已有文献报道，通过PCR技术引入F185K和C280S突变于 HIV-1整合酶cDNA片段中，可增加整合酶的溶解度。纯化后的HIV-1整合酶不需要特殊的细胞因 子，在体外反应体系中即可显示3’切割活性和链转移活性，可用于体外抗HIV-1整合酶药物筛选。

【发明内容】：本发明目的是构建一种快速，灵敏，干扰因素少，成本低的HIV-1整合酶抑制 剂体外筛选模型，即整合酶切割质粒筛选模型。

本发明利用工程菌诱导表达并纯化得到可溶性整合酶，再构建整合酶作用最佳底物质粒，并 将整合酶和检测样品一同加入反应体系，整合酶可将超螺旋底物质粒线性化。利用DNA电泳和凝 胶成像分析技术可快速检测样品活性。整合酶体外切割质粒的筛选模型简单、易操作，可在1小 时内完成对样品整合酶抑制活性的检测，并可开发制成基因芯片，进行大规模检测。

本发明提供的HIV-1整合酶表达菌株，通过如下步骤构建得到：

第1、根据HIV-1整合酶基因序列（来自质粒pNL4-3，可在NCBI中查得）、需要突变的位点 F185K和C280S、以及LTR序列（来自质粒pNL4-3，可在NCBI中查得）设计引物并由扩增得到目 的片段；

第2、将第1步得到的目的片段连接到pET28a载体并转化大肠杆菌构建工程菌，即得到HIV-1 整合酶表达菌株。

所述的HIV-1整合酶表达菌株的构建方法的具体步骤如下：

第1.1、引物合成

根据整合酶基因序列设计引物：

His-Primer1:5’-CAGCATATGTTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGATGAAC-3’

NdeI酶切位点：CATATG；起始密码子：ATG

Primer2:5’-ATAGGATCCTTACTAATCCTCATCCTGTCTACTTGCCACAGAATCATCACCTGCC-3’

BamHI酶切位点：GGATCC，终止密码子：TTA、CTA；突变位点：AGA，得到C280S；

Primer3:5’-CCACAATAAAAAAAGAAAAGGGGGGATTGGG-3’

突变位点：AAA，得到F185K；

Primer4:5’-CCCAATCCCCCCTTTTCTTTTTTTATTGTGG-3’

突变位点：TTT；

LTR-Primer1:5’-CAGTGGATCCGACTGTGGAAGGGCTAATTTGGTC-3’