[发明专利]一种诱导草坪草腐霉枯萎病病原菌有性世代的方法

说明书

技术领域    本发明是草坪草腐霉枯萎病病原菌有性世代诱导的方法，属于农业微生物技术领域。

背景技术

全世界的腐霉属(Pythium)真菌有120多种，其中能对草坪草产生危害的有几十种，中国报道有55种。由腐霉属引起的草坪草腐霉枯萎病是一种毁灭性病害，引起根、茎和心叶腐烂，发病条件适宜时，能在一夜之间毁坏大面积草坪，对景观效果破坏极为严重。病原菌致病种的差异可引起草坪不同器官和受侵染的程度不同，所采取的相应的防治措施也不尽相同。因此病原菌致病种的鉴定对于病害的预防和防治工作具有积极的指导作用。

目前，腐霉属间种的区分的主要依据为有性繁殖结构和无性繁殖结构的不同形态特征。无性繁殖结构主要是孢子囊等，有性繁殖结构通过卵孢子直径、满器或不满器、雄器性态、藏卵器表层平滑或是否具刺等作为分类依据。关于草坪腐霉属的有性态诱导的报道不多，一般采用CMA、Petri液或PS液诱导。但一般诱导时间较长(CMA一般21d后形成有性态器官，petri液也需要48h)。徐作珽等在研究番茄茎腐病病原菌时使用Petri液诱导有性态，48h后能形成雄器和藏卵器。王国良等在研究草坪腐霉枯萎病菌时采用CMA培养基。陆家云等以PS液作为腐霉菌有性态的诱导方法。

以上各诱导方法虽然能形成有性态器官，但诱导时间较长，并且诱导液的配制也相对繁琐。本研究是在Petri液的基础上，研究单营养元素对草坪腐霉枯萎病病原菌有性世代诱导的影响及影响力大小。研究结果表明，采用c_acl₂溶液诱导有性世代，不仅诱导数量多、速度快，而且诱导溶液的配制也相对简单，并且可伴随有孢子囊的出现，这样，省去了无性态诱导的过程，大大节省了病原菌的鉴定时间，提高了鉴定效率。

发明内容

本发明提供一种草坪腐霉枯萎病菌病原有性世代诱导的方法。在诱导溶液中培养草坪草腐霉枯萎病病原菌的菌丝，27℃静止培养，12h后即可形成藏卵器，16h后可形成大量藏卵器和雄器，并且伴随有孢子囊的出现。病原菌的有性态和无性态结构特征可一步完成。发明内容如下：

1.诱导液的配制：在200ml灭菌水中加入0.012g CaCl₂，摇匀。

2.诱导过程：在配制好的CaCl₂溶液中少量、多次挑取草坪腐霉枯萎病病原菌菌丝，置27℃生化培养箱中静止培养。12h后可观察有性态结构特征。

本发明中的诱导液配制简单，诱导过程短，并且有性态和无性态器官可同时出现，鉴定过程可一步完成，大大节省了诱导时间，提高了鉴定效率，更适宜于大量病原菌的鉴定。

具体实施方式

1.病原菌来源：采集草坪腐霉枯萎病典型病样，采用常规的组织分离法进行病原菌的分离。纯化后置PDA试管斜面保存。

2.病原菌扩繁：在PDA培养基上接种试管保存的病原菌，27℃生化培养箱中培养48h。

3.诱导液的配制：在500ml三角瓶内装入200ml蒸馏水，121℃高压灭菌25分钟。1/10000天平称取CaCl₂分析纯0.012g，无菌条件下置于晾凉的200ml灭菌水中，摇匀。

4.病原菌接种诱导液：无菌条件下，用接种针将扩繁好的病原菌菌丝少量、多次分别挑取到诱导液和灭菌水中(灭菌水培养为对照)。

5.培养过程：将接种好的诱导液和灭菌水置于27℃生化培养箱中，静止培养。12h后观察有性态器官的形态特征。