[发明专利]一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养基，更具体地说，涉及一种培养间充质干细胞的完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞已成为再生医学、组织工程、细胞治疗和移植、基因治疗领域的研究焦点。理想的干细胞治疗策略要求干细胞既具有全能的分化潜能又具有自我更新能力。目前研究的最多的是间充质干细胞，该细胞所具有的自我更新、多向分化、归巢到病变组织及免疫调节的特性，使其成为细胞治疗和组织工程中很有前景的种子细胞。2006年，国际细胞治疗协会明确提出了间充质干细胞的定义：(1)贴壁生长；(2)表达CD105、CD13和CD90，不表达CD45，CD34，CD117，和HLA-II类分子；(3)能在体外分化为脂肪、骨和软骨细胞。骨髓来源的间充质干细胞因其易获得性，可多向分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞成为间充质干细胞研究的主要对象。目前，除骨髓外，已从很多组织如脐带、脐血、脂肪、胎盘、羊膜、脂肪、骨膜、滑膜、滑膜液和多种胎儿组织(骨髓、肺、肝、胰腺、脑)分离得到间充质干细胞。因此，间充质干细胞的多种组织来源的特点使其成为细胞治疗、基因治疗以及骨或软骨组织工程的一个崭新而丰富的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。然而，刚分离出来的原代间充值细胞数量太少，难以满足临床治疗和研究方面的需求。因此，需要在体外对间充质干细胞进行大量培养，这就要求有良好的细胞培养试剂为细胞的生长和扩增提供适合的环境。

目前用于间充质干细胞的培养试剂主要有美国Stem Cell公司的Mesencult^TM培养试剂或在美国GIBCO公司的基础培养基(DMEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640等)基础上添加血清、胰岛素和(或)细胞因子得到完全培养基。不同组织来源的间充质干细胞所用的基础培养基可能会有不同。其中DMEM/F12作为DMEM和F12的混合培养基，结合了这两种培养基的优点，能够适合更多组织来源的间充质干细胞。关于血清的浓度，现有的间充值干细胞培养方法一般必须使用终浓度至少10％(体积比)的血清，才能保证细胞的正常生长传代。然而间充质干细胞在高浓度血清中培养时，随着传代次数的增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，血清成分不明确，既包含促进细胞生长、稳定解毒的物质；也包含低水平的抑制细胞生长的物质。血清还存在添加及补充过程中导致培养基pH值变化大，含有潜在的病毒或支原体污染、存储过程中易受其他微生物污染，低温贮存解冻后易产生沉淀，不同批次差异大，成本高，以及难以从细胞下游产品中去除等缺点。因此，在间充质干细胞培养试剂中尽量不用或少用血清成为培养领域需要解决的一个问题。虽然研究人员尝试了很多的无血清培养基，但是间充质干细胞在无血清培养条件下，增殖缓慢，随着传代次数的增加处于负增殖状态，并且存在向骨和软骨细胞分化的能力消失的问题。至今间充质干细胞的无血清培养基的研究也未获得重大突破。现有的技术一般通过额外添加细胞因子等成分来减低血清的使用量。有人发现表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)对间充质干细胞有较强的促增殖作用。

综上所述，亟需开发出一种新的适合于多种组织来源间充质干细胞生长的完全培养试剂，可以在尽量低的血清浓度同时又不会过多的增加别的成分的情况下促进细胞的生长。但是，迄今为止，尚未见新的间充质干细胞完全培养基方面的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种与以往的高血清浓度培养试剂相比可以显著增加所得间充质干细胞的一种低血清浓度的完全培养基；提供一种扩增培养间充质干细胞的可重复性方法，以满足有关领域的需要。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，包括细胞基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；所述细胞基础培养基可以是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640和IMEM等中的任意一种或其任意组合，所述胎牛血清的终浓度为1-100μl/ml，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为1-100ng/ml。