[发明专利]一种林可霉素产生菌的筛选方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及林可霉素产生菌的筛选方法，特别是涉及一种可以提高林可霉素产量的突变菌的筛选方法。

背景技术

林可霉素，又称洁霉素，是由林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的林可酰胺类抗生素，组分包括氨基酸和糖，是由L-酪氨酸和戊糖磷循环(戊糖-5-磷酸和景天糖-7-磷酸)的中间产物缩合而成，整个生物合成途径包括2个分支：一个由L-酪氨酸合成丙基脯氨酸(PPL)，另一个由景天糖-7-磷酸构成α一甲硫林可胺(α-MIL)，是经三级有氧发酵生产的。抗革兰氏阳性菌，临床主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，具有疗效显著，副反应少，不易产生交叉耐药性等特点，广泛运用于临床。另外其深加工衍生物用量不断地加大，是一种很有前途的抗生素，所以提高林可霉素的生产水平势在必行！而筛选高产林可霉素的菌株是提高林可霉素的生产水平最为有效的途径之一。

目前，筛选高产林可霉素的菌株的方法有：用紫外线/氯化锂复合诱变剂对林可霉素产生菌进行处理，并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选.结果：筛选出的菌株在摇瓶中的发酵单位比对照菌株提高了21.73％；而用热诱变对林可霉素产生菌进行处理，并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选，结果：筛选出的菌株在摇瓶中的发酵单位比对照菌株提高了23.53％；这些筛选林可霉素高产菌株方法，对林可霉素产量提高不大，效果仍不甚理想。

发明内容

因此人类对提高林可霉素产量的高产菌株的筛选方法仍存在需求，至今为止，还没有发现任何有关本发明的报道，本发明人经过反复研究，终于找到了提高林可霉素产量的高产菌株的筛选方法，完成了本发明。针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就在于提供一种提高林可霉素产量的突变菌株的筛选方法。

为达到上述目的，本发明所述的筛选方法如下：

将冷冻保藏的沙土管接入斜面培养成熟后，作为出发菌种，刮去适量孢子经无菌水稀释后，注入N⁺进行诱变处理，在含有蛋氨酸的培养基上培养，用琼脂块培养法进行初筛，用一级、二级发酵培养基发酵培养进行复筛，将选出的高产突变株进行遗传稳定性试验，即可获得目的菌株。

所述诱变剂N⁺注入剂量为5-50keV，抗性物质蛋氨酸浓度百分比为0.1-4.0％。

所述一级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、豆粉1.0-3.0％、蛋白胨0.3-0.7％、葡萄糖0.5-1.5％、KNO₃0.1-0.3％、NaH₂PO₄0.4-1.0％、CaCO₃0.1-0.5％、余量为水，pH 6-8；

250mL三角瓶装液30mL，25-35℃，220r/min条件下培养40-60h；

所述二级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、葡萄糖0.5-1.5％、豆饼粉0.5-2.0％、水解蛋白0.5-1.0％、NH₄)₂SO₄0.1-0.5％、Mg₂SO₄0.05-0.2％、KH₂PO₄0.01-0.05％、CaCO₃0.1-1.0％、余量为水，pH 6-8；

250mL三角瓶装液30mL，由一级发酵液按5％接种量接种，25-35℃，220r/min条件下培养100-120h；

在本发明中，由于质、能、荷三因子的协同作用，离子束注入引起大量受体原子移位、重组和生物大分子的变异，形成新的分子结构和基因，产生丰富的基因突变，因而离子注入可以在损伤较轻的情况下获得较高的突变率。利用林肯链霉菌对自身产物及其前体物的抗性筛选，有明确的方向性，更有利于加快筛选工作的进程，扩大筛选的规模，增加正突变率。本发明以林可霉素前体物-蛋氨酸为添加剂，利用林可霉素抗性筛选法作为诱变育种的辅助筛选手段，结合氮离子注入诱变，进行定向育种，大幅提高了筛选效率。

本发明采用林可霉素抗性筛选结合离子注入诱变方法，选育林可霉素产生菌获得较好的效果，通过多轮选育得到一株发酵效价提高81.4％且遗传性状稳定的突变菌株。并研究了不同离子注入参数对菌株存活率的影响，总结离子注人对林肯链霉菌产生的生物学效应，为进一步优化离子注入参数用于选育高产林可霉素产生菌株提供参考，使用林可霉素抗性作为筛选手段大大提高了正突变菌株的选育效率。

附图说明