[发明专利]川牛膝药材指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

说明书

技术领域

本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，尤其是一种川牛膝药材指纹图谱的构建方法。

背景技术

中药虽然已有几千年的应用发展历史，但如何有效地评价中药/中药材质量的好坏，一直是中药研究与应用的重点与难点问题。随着科技的发展，指纹图谱质控技术在中药领域被提出并得到广泛认可，其在中药材及其提取物/制剂等质控中的应用也越来越多，它为中药材及其相关产品的质量控制及评价提供了新的思路和方法。

就如每个人都有指纹，但每个人的指纹却各不相同；每一味中药材也都具有自己的“指纹”。但中药材的指纹却并不是直观的，并且由于每一味中药材的特性和有效成分千差万别，对其指纹图谱的构建方法显然也不可能一概而论，而是需要针对其不同中药材不同的特性及有效成分甚至所含杂质等情况，设计特定的提取分离等前处理方法及相应的指纹图谱测定方法，从而分别确立适合每一味中药材的指纹图谱构建方法及其标准指纹图谱，其所获得的指纹图谱必然也是千差万别。

目前获得指纹图谱的主要手段是色谱法和光谱法，其中比较常用的有以下几种：

(1)薄层色谱法：常用于中药中各种成分的鉴定。

(2)高效液相色谱法：是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。

(3)气相色谱法：适合于挥发性药材及制剂的指纹图谱研究。

(4)毛细管电泳技术：已用于中草药中生物碱、黄酮/黄酮苷、酚酸、香豆素、醌类、强心苷、葡萄糖异硫氰酸盐等物质的分析。

(5)红外光谱法：可用于药材鉴定和成药鉴别。但红外光谱是由分子的振动-转动跃迁引起的，确定其专属性和特征性有较大困难。

(6)紫外光谱法：是电子光谱，形状变化不大，有时不同的化合物有相似的图谱，专属性差。

(7)分子生物学方法：不同生物体有各自相对稳定的DNA序列，因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图谱。限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)技术和随机扩增多态DNA(RAPD)是目前最常用的构建DNA指纹图谱的方法。但RFLP技术繁琐，要求的DNA量大，实验材料必须新鲜，因此其应用受到限制；而RAPD法可以在特异DNA序列尚不清楚的情况下检测DNA的多态性，具有灵敏度高、多态性强的优点，同时分析的是基因型而非表现型，结果不受材料来源、环境因素、样品形态等影响，为干燥药材鉴定提供了更加准确的手段。但RAPD法的重复性差等问题引起了许多争议。

色谱法与DNA指纹图谱相比其优点在于：不但有特征的体现((各种化学成分的个数和相对位置--保留时间)可作定性鉴别使用，还可体现量的概念。

但是，应用色谱技术构建指纹图谱时，色谱图中各色谱峰的保留值通常会受各种因素的影响，包括一系列的操作因素，甚至色谱柱本身在实验过程中的变化等。并且因为中药材是生物样品，存在明显的个体差异，再加上产地、批次、运输、贮存等的不同，即使同种中药也会出现不同的色谱峰，不同种中药有时会出现相同的色谱峰。所有这些都给指纹图谱的分析带来了巨大的困难。解决这一难题就需要进行大批量实验研究、收集大批量仪器分析数据，并对大批量仪器分析数据进行处理，从中提取特征信息，进而加以识别，从而确立专属性强、并且稳定有效的指纹图谱构建方法，得到可有效用于中药材质量评价的标准指纹图谱。

川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)为苋科(Amaranthaceae)杯苋属(CyathulaBlume)多年生草本植物，别名甜膝。主要分布于四川、云南和贵州，野生或栽培，生长于海拔1500米以上的地区，为著名的川产地道中药材，是极常用且是重要的出口品种。1977年以后各版《中国药典》确定川牛膝植物来源为C.officinalis Kuan.。川牛膝的主要成分为生物碱和甾醇类物质，如杯苋甾酮(cyastelone)、头花蒽草甾酮、促脱皮甾酮、红甾酮等，另外还有阿魏酸；现代研究还从川牛膝根中提取出一种生物活性多糖--牛膝多糖(Achyranthes bidentata Polysaccharides，ABP)。川牛膝的主要药理作用有活血通经、祛风湿、通利关节、利尿通淋，以及对高血压性心脏病和痛经等疾病的治疗作用。