[发明专利]增强体外基因转录翻译效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的高效率制备蛋白的方法，具体是一种增强体外基因转录翻译效率的方法。

背景技术

常规蛋白质制备技术是把基因片段克隆入蛋白表达载体，然后转入大肠杆菌DH5α或昆虫或酵母中，进行诱导表达，然后，裂解并分离纯化出表达的蛋白。这种方法比较复杂，获取蛋白产物效率也比较低，更重要的是有时产物无活性。随后罗氏公司等推出了体外快速翻译系统试剂盒(Rapid Translation System，RTS)，在5小时内制备毫克级蛋白。此系统采用了一个配套的转录-翻译反应，用于体外蛋白合成，在此系统中，T7RNA聚合酶转录模板基因，来自大肠杆菌裂解物的核糖体起始新生的mRNA翻译成蛋白，转录与翻译同步进行。这种无细胞转录翻译系统具有显著的优势。如制备的产物快速，易纯化，可以用于毒性蛋白的制备。但是，大量实验发现，此系统表达成本高，表达产物效率低，产率最高在1毫克/毫升试剂蛋白量。如何提高此系统表达效率，增强蛋白产率，是该技术领域中的一个难题。

经对现有技术的文献检索发现，Iskakova MB等在Nucleic Acids.Res.(核酸研究)2006年第34卷e135中报道采用降低反应温度到20℃可以增加产物量。Kim DM与Swartz JR在Biotechnol.Prog.(生物技术进展)2000年，第16卷385-390页报道在反应进行数小时后，第二次加入氨基酸混合物，延长反应时间，可以增加产物量。Makarova OV等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)1995年92卷第12250-12254页报道采用突变T7RNA polymerase方法可以增加反应产物量.但是这些方法存在过程复杂、需特殊处理、成本高的缺点与不足。

纳米材料具有独特的物理、化学、光学、生物学等特性，为增强体外基因转录翻译效率带来了新的机遇。到目前为止，无加入纳米粒子增加反应产物与反应效率的报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种增强体外基因转录翻译效率的方法，把制备的不同尺度的金纳米粒子(5nm至40nm)直接加入到体外基因转录翻译试剂中，解决体外基因转录翻译效率低的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明将5nm至40nm之间的金纳米粒子，加入到体外基因转录翻译试剂盒中，金纳米粒子最终浓度控制在1.2nM之内，采用常规反应条件，可以获得比无金纳米粒子的反应更高的蛋白产物，而且不影响蛋白产物的活性，从而增强体外基因转录翻译效率。

所述的金纳米粒子为5nm至40nm之间的任一种金纳米粒子或者它们之间的任意混合。

所述金纳米粒子最终浓度控制在0.12nM-1.2nM之间。

所述体外基因转录翻译试剂盒，为现有技术，可以是美国罗氏公司EcoliRTS100试剂盒(基于大肠杆菌提取物体外快速翻译系统100型试剂盒)，也可以是罗氏公司RTS100 Wheat Germ CECF试剂盒(基于麦芽提取物无细胞延续交换体外快速翻译系统100型试剂盒)。

所述采用常规反应条件，具体为：对于Ecoli RTS100试剂盒，反应温度为30℃，反应时间为5小时；对于RTS100 Wheat Germ CECF试剂盒，温度为20℃至25℃之间，反应时间为17小时。

本发明反应结束后，蛋白产物可通过蛋白电泳、Western blotting进行活性与蛋白含量鉴定。

经研究发现，金纳米粒子能够显著提高体外快速翻译系统试剂盒的效率，缩短了反应时间。本发明利用金纳米粒子特有的催化性能，优化体外基因转录翻译系统的条件，目标是增强体外基因转录翻译的效率与蛋白产量。方法简单，成本低，适用于大规模蛋白制备，基因转录翻译的调控，毒性蛋白的结构与功能研究。常规的生化实验室都具备实验条件，便于推广。

本发明按照正常反应条件，对于Ecoli RTS100试剂盒，在5小时内可显著增强目标蛋白的产量达10-30％；对于RTS100 Wheat Germ CECF试剂盒，在17小时内可显著增加目标蛋白的产量达10-30％。此方法具有简单、快速、效果显著的特点。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明实施例中的5nm至40nm金纳米颗粒，可以采用以下采用柠檬酸还原法制备，具体操作为：

1.容器的清洁