[发明专利]检测水体中综合毒性的方法

权利要求书

1.一种检测水体中综合毒性的方法，其特征在于：利用荧光素酶代替发光细菌进行水体综合毒性检测，荧光素酶是一种从荧火虫体内提取出来的或利用基因工程技术得到的商品化的酶制剂，该酶对环境中或水体中存在的痕微量有毒有害物质非常敏感，当水体中存在有害物质时会改变荧光素酶的活性，从而使该荧光素酶在三磷酸腺苷存在的条件下催化D-荧光素的反应受到抑制，导致该反应所产生的光强度随着水样中毒物量的含量而改变，根据化学发光强度的降低程度来判定水样的综合毒性，具体包括以下步骤：

第1步：反应体系缓冲液的制备，反应体系缓冲液包括A液-酶促反应缓冲液、B液-底物稀释液、C液-荧光素酶贮存液及D液-底物应用液，其中：

A液的配制方法：N-三羟甲基甘氨酸20ml～100ml，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液5ml～20ml，将这两种缓冲液混合，将混合液的pH调为6.0～8.5；

B液的配制方法：称取牛血清白蛋白5mg～20mg，MgCl₂.6H₂O 30mg～60mg，二硫苏糖醇2mg～10mg，最后用A液定容至10毫升；

C液的配制方法：将荧光素酶冻干粉用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.15mg/ml～0.55mg/ml的荧光素酶贮存液；

D液的配制方法：先将D-荧光素用pH7.5的0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为0.2mg/ml～1.0mg/ml溶液，然后取该溶液5μL～15μL，B液500μL～1500μL，C液50μL～150μL，最后将这三种溶液混合即成为底物应用液D；

第2步：用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液配制成浓度为2.0mg/ml～10.0mg/ml的三磷酸腺苷二钠贮存液，配制三磷酸腺苷二钠应用液时，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液稀释5～50倍；

第3步：取聚四氟乙烯材料制成的反应杯或48塑料孔培养板，进行空白测试时，每次做三个平行样，先向每杯或每孔中分别加入A液250μL，D液50μL，二次蒸馏水100μL，室温孵育15分钟～25分钟，然后将上述各反应杯或培养板放入发光检测仪中，向各反应杯或塑料孔中加入三磷酸腺苷二钠应用液100μL，用移液枪吹打混匀，15秒～30秒后记录发光强度，在测试每个水样时，也做三个平行样，测试方法基本同空白样测试，不同之处时用待测水样替代二次蒸馏水，按照下面的公式计算待测水样的发光强度：

相对发光强度＝样品三个平行样的平均发光值÷空白三个平行样的平均发光值×100％；

根据计算出的发光强度，参照中国1995年制定的水质急性毒性的检验标准方法——GB/T15441-1995中的结果判定方法，确定检测水体中综合毒性。

2.根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述A液的配制方法中，N-三羟甲基甘氨酸浓度为0.025mol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.5。

3.根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述A液的配制方法中，混合液的pH用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L NaOH调为6.0～8.5。

4.根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述C液的配制方法中，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，pH 7.4。

5.根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述C液的配制方法中，荧光素酶贮存液按100微升每管，分装冻存于-80℃～-20℃冰箱中。

6.根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述D液的配制方法中，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.5。

7.根据权利要求1所述的检测水体中综合毒性的方法，其特征是，所述第2步中，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.5。