[发明专利]一种乳酸链球菌素的HPLC检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵液中目标产物的检测，尤其涉及一种乳酸链球菌素的高效 液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin，又称乳球菌肽或乳链菌肽)是由乳酸链球菌 (Lactococcus lactis ssp.lactis)在代谢过程中合成和分泌的具有较强抑菌 作用的小分子肽，也是目前研究最多、应用较广的细菌素之一。Nisin是目前在 国际上允许商业化生产的少数天然食品防腐剂之一，广泛应用于乳制品、发酵 饮料、罐藏食品、肉类及肉制品的防腐保鲜，它能够有效抑制引起食品腐败变 质的革兰氏阳性细菌(G⁺)及病原菌的繁殖。与其他防腐剂相比，Nisin是由天 然存在的Lactococcus菌产生且对蛋白酶特别敏感，在消化道中很快被α-胰凝 乳蛋白酶分解。因此它对人体基本无毒性，也不与医用抗生素产生交叉抗药性， 能在肠道中无害地降解。其结构见图1。

Nisin于1928年被Rogerst Whittier首先发现。最早实现工业化生产的 是英国Aplin&Berrett公司，随后美国、英国等50多个国家和地区也相继批 准Nisin为天然食品防腐剂。我国对Nisin的研究始于1989年。我国实现工 业化生产的菌种L.laticsAL2产生的是NisinZ。1990年，Nisin被列入我国国 标GB2780-86的1990年增补品中。

早期，在Tramer等提出琼脂扩散法之前，人们普遍采用的是试管稀释技术 和浊度测定法(Turbidity Assay)。1964年Tramer和Fowler建立了琼脂扩散 法的基本方法，但由于nisin的分子量较大，酸性条件下溶解性较好，而在中 性环境下溶解度很小，所以很难在琼脂中扩散。后来Wolf等进一步对琼脂扩 散法进行了优化。他们优化的参数有：指示菌、琼脂的深度和浓度、Tween20 的浓度、培养基中所加的缓冲剂等。Wolf等的改进方法与Tramer等的最初的 方法相比，精确度提高了57％，准确性提高了12％，因此目前用于检测食品中乳 链菌肽含量的最常用的方法是琼脂扩散法(分析检验食品科学2005，Vol.26， No.7175，管碟法测定nisin效价的改进；食品科学2007，Vol.28，No.03175， 琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化；国外医药抗生素分册2004年9月第25 卷第5期，细菌素Nisin的检测方法)。

HPLC与琼脂扩散法比较具有快速，准确，重复性好等优点。现有HPLC技术 提到用RP-HPLC Hi-Pore RP-318(BioRad)、250×10mm的柱，在30℃使用流动 相A为10％(V/V)乙腈添加0.1％三氟乙酸，流动相B为90％乙腈添加0.07％三 氟乙酸梯度洗脱。流动相B的起始浓度为25％终止浓度为28％，且在梯度洗脱 中浓度的变化为逐渐递增的(Eur.J.Biochem.201，581-584，1991， Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z，a natural nisin variant)。用此方法分析样品的时程长，近1小时，梯度洗脱 基线漂移，造成积分困难，样品测定结果的重现性、准确性等差。发明人按该方 法而HPLC谱中没有目标峰。

因此，本领域迫切需要提供一种运行时间短、基线稳定、分离度良好的检 测乳酸链球菌素的HPLC方法。

发明内容

本发明旨在提供一种乳酸链球菌素的高效液相检测方法。

在本发明中，提供了一种乳酸链球菌素的检测方法，所述的检测方法为高效液 相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)，其流动相中含有乙 腈和水，乙腈的起始浓度为5-25vol.％，最终浓度为35-100vol.％。

在另一优选例中，流动相中的乙腈在15-40分钟从5-25vol.％递增至35- 100vol.％。

在另一优选例中，流动相中的乙腈在20-35分钟从10-22vol.％递增至35- 80vol.％。