[发明专利]氧化锌量子点标记抗体的荧光免疫测定方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫测定技术领域，涉及一种利用氧化锌量子点进行免疫测定的方法。

背景技术

纳米结构氧化锌除了独特的半导体光电特性之外，还具有对生物安全无毒、能与蛋白质等生物分子以氢键或其他方式螯合并能很好的保持其生物活性、具有较高等电点等优异的性能，这使其在生物/化学传感器方面具有重要的应用。

目前，低浓度抗原的检测是临床医学和诊断学面临的重要课题。能成功检测低浓度的抗原，可以为相应的疾病早期诊断和治疗提供科学的依据。抗原浓度检测的传统手段是先进行病毒培养以提高疾病抗原的浓度，然后辅以光化学检测法或其他检测方法确定抗原浓度并推算出原始浓度。这种方法的局限性在于其周期长，精确度差等，可能延误疾病的发现和最佳治疗时机。利用纳米材料构建生物/化学传感器进行电化学检测抗原的方法因其检测限低、检测快速、选择性好等优点正逐渐受到越来越多的重视，但由于早期疾病期相应抗原的浓度极低，因此如何使低浓度的抗原产生明显的检测信号是这种方法亟待解决的重要问题之一。

发明内容

技术问题：本发明针对上述技术缺陷，提供一种氧化锌量子点标记抗体的荧光免疫测定方法，该方法利用氧化锌标记抗体检测低浓度抗原，对相应抗原的检测限低、选择性好、灵敏度高、稳定性好。

技术方案：在本发明中，利用简单的液相反应制备氧化锌量子点，得到了粒径均一，分散性好的氧化锌量子点，把量子点标记到抗体上。同时在自制的电解池中在载片上固定化一层抗体，在特定浓度的待测抗原溶液中，使标记了氧化锌量子点的抗体和载片上的抗体均与抗原进行特异性结合，把标记在抗体上的氧化锌量子点连接到载片上。然后测定载片上氧化锌量子点的荧光强度，建立氧化锌荧光强度与与抗原浓度之间的关系，从而确定待测抗原浓度。

利用液相反应制备氧化锌量子点，得到粒径均一、分散性好的氧化锌量子点，把该量子点标记到抗体上；同时在电解池中的载片上固定化一层抗体，在一系列已知浓度的待测抗原溶液中，使标记了氧化锌量子点的抗体和载片上的抗体均与抗原进行特异性结合，把标记在抗体上的氧化锌量子点连接到载片上；然后测定载片上氧化锌量子点的荧光强度，建立氧化锌荧光强度与与抗原浓度之间的标准对应关系，用实际样品检测时得到的氧化荧光强度与此标准对应关系相对照即可确定实际样品的抗原浓度。

本发明的技术解决方案具体为：

第一步：二水合乙酸锌与乙醇按2∶1～25∶1克/升混合，60～80℃回流2.5～4小时，溶解，冷至室温；

第二步：一水合氢氧化锂与乙醇按0.6∶1～6∶1克/升混合，超声溶解；

第三步：将第一步和第二步所得溶液混合，置于高压釜中，密封，使其能承受压力不小于2×10⁵Pa，加热至60～100℃，保持0.5～3小时，自然冷却至室温，取出，离心，用去离子水清洗三次，得到氧化锌量子点；

第四步：将氧化锌量子点分散到抗体溶液中，氧化锌量子点质量与抗体溶液体积比为2.5∶1～25∶1克/升，33～37℃震荡1～3小时，离心，用pH6.8～7.5磷酸盐缓冲溶液清洗三次；最终分散于pH6.8～7.5磷酸盐缓冲溶液中，不用时保存于冰箱保温层；

第五步：载片修饰，分两类载片，①金片，浸于等摩尔浓度的5～15毫摩尔/升的11-巯基-十一烷酸(MUA)和11-巯基-十一烷醇(MU)的乙醇溶液中，0～8℃保持18小时，取出用去离子水清洗；②二氧化硅片或玻璃片，浸于5～15毫摩尔/毫升3-胺基-三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，35～45℃保持2～5小时，用去乙醇清洗，再浸于5～15毫摩尔/毫升戊二醛水溶液中1～3小时，取出，用去离子水清洗；

第六步：将第五步得到的载片安装到自制的电解池中，向电解池中注入抗体溶液，使注入的抗体溶液体积至少能全部浸没反应液腔内的载片面积且至多不溢出反应液腔，33～37℃保持1～3小时，用pH6.8～7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗；

第七步：向电解池中注入的抗原溶液，使注入的抗原溶液体积至少能全部浸没反应液腔内的载片面积且至多不溢出反应液腔，33～37℃保持1～3小时，用pH6.8～7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗；

第八步：将第四步制得的标记了氧化锌量子点的抗体溶液注入电解池中，使注入的溶液体积至少能全部浸没反应液腔内的载片面积且至多不溢出反应液腔，33～37℃保持1～3小时，用pH6.8～7.5磷酸盐缓冲溶液注入清洗，取出载片，室温真空干燥2小时；

第九步：测定载片上氧化锌量子点的荧光强度；