[发明专利]棉花纤维发育中两个新的microRNA基因与用途

说明书

一、技术领域

本发明涉及与陆地棉纤维发育相关的两个未知miRNA(ghr-MIR3和ghr-MIR9)基因的克隆、鉴定和用途。建立了野生型(WT)和无绒无絮纤维突变体(M)两个小分子RNA文库，采用了目前国际最先进的高通量测序列技术，获得了上述两个新的miRNA基因序列。进一步分析了该miRNA的两个靶基因，分别编码叶绿体omega 3-脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶，两者分别控制纤维的伸长发育及细胞壁的形成和加厚。本发明属于生物技术领域。若以该miRNA及其靶基因作为目的基因对棉花进行深入的功能研究，在一定程度上可有效地提高棉纤维的品质，具有一定的经济及社会效益。

二、背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类新发现的非编码、长度约为21nt的单链小分子RNA。近年来的大量研究表明，miRNA在调节植物生长发育，细胞增值、胁迫响应等过程中发挥着重要的作用。棉花是一种重要的经济作物，其纤维是天然纺织材料的主要来源。我国是世界上最大的棉花生产和消费国，也是一个重要的棉花贸易国，因此，棉花作为经济作为在我国更是具有举足轻重的地位(http://www.emergingtextiles.com)。棉花纤维的发育机理成为备受关注的热点，因为它关系到如何提高棉纤维产量(提高单位面积棉纤维伸长的数量)，改良纤维品质，而所有这些是与纺织工业和民生密切相关的现实问题。

随着现代分子生物学技术的发展，国内外除了利用常规育种手段外，逐步运用基因工程技术对棉纤维品质进行遗传改良。利用基因工程改良纤维品质依赖于对纤维发育相关基因及其调控元件的认识。因此，开展分离、鉴定与棉花纤维发育相关的功能基因是培育优质棉纤维新品种，实现育种理论和关键技术新突破的重要基础，也是提升我国棉花育种原始创新力的关键举措。

2007年我们实验室率先在已有的棉花基因组中挖掘出了37miRNA。这也是国内外迄今为止从棉花植物中发掘到最多的miRNA。这些重要的miRNA基因对调控棉花生长及纤维发育具有重要的生物学意义及潜在的生产开发价值。虽然目前已经知道与棉纤维发育相关的基因有上千个，但对这些基因的表达机理及网络调控知之甚少。因此，迫切需要对我国已有的特色棉花资源，通过大规模克隆方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA(包括其它sRNA)基因，为后期定向改良和培育优质性状的棉花种质奠定基础。

本专利所克隆到的两个新的miRNA来自于陆地棉品种，而且只在突变体中表达，表明在野生型中这两个miRNA不表达，因此它们不会对叶绿体ω-3-脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶基因的转录产物mRNA进行转录后的切割抑制。ω-3-脂肪酸脱饱和酶在植物中催化脂肪酸脱饱和生成三烯脂肪酸，后者对维持细胞膜的功能起着重要的作用。更重要的是三烯脂肪酸是茉莉酸合成的前体，而茉莉酸对细胞壁的形成有调节作用。乙醇脱氢酶在细胞壁中以众多的代谢物为底物催化木质素的铰链，形成细胞壁的成分。因此，两者可能对纤维细胞壁的合成有着重要的影响。

事实上，脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶是多功能酶，这两种酶参与植物对冷害胁迫反应的调节，基因突变导致植物对冷胁迫的高度敏感。两者可能在棉花植物开花吐丝后期由于气温较低调节棉纤维的生伸发育。但是上述两个靶基因在调节棉花纤维合成中的具体功能还不清楚。因此，通过研究miRNA的调节功能系统研究脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶在棉花纤维发育中的作用具有重要的生物学意义和潜在应用价值。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是克隆陆地棉纤维发育过程中两个重要的miRNA(ghr-MIR3和ghr-MIR9)，分析和鉴定了二级结构，同时分析得到了两个靶基因，叶绿体ω-3-脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶基因，分析表明它们参与了棉纤维发育过程中细胞壁的合成。以此基因为基础，通过基因工程的方法改变目前棉纤维的品质特性，获得一定的经济及社会效益，为棉花的品质育种提供基因资源，尽快提高我国棉花品种的纤维品质。

技术方案

陆地棉pre-ghr-MIR3(基因表达前体)，长度为205bp，序列如下：

AACTAATCCTTGTACATTAGATCAAAGAGCAAACTTATCATTTCTATTAAAAACTAACGTGATTGATGGA

TTAACCAGACAGTTACACGTAGCGTGCCACATGTATCTCATTTGAGAGGTAGGCACAAGTTTTTAGCAA