[发明专利]青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程应用，属于基因工程领域。

背景技术

绝大多数的革兰氏阴性细菌的hrp基因簇能在非寄主植物上引起过敏性反应，而在寄主植物上表现出致病性。hrp基因的产物在其表达及分泌过程中起着调控作用。如Erwinia amylovora的HrpN，Pseudomona syringae的HrpZ以及Ralstonia solanacearum的PopA类似的Harpin蛋白已经被鉴定出来，它们能够通过三型泌出系统分泌到胞外引起非寄主植物发生过敏性反应，是一类富含甘氨酸和丝氨酸，缺少半胱氨酸并且耐热的一种蛋白，在氨基酸序列上没有相似性。

青枯病菌能够在全世界范围引起数百种农作物的发生萎蔫，包括番茄、马铃薯、烟草、花生和香蕉等。病菌通过寄主根部伤口侵染进入木质部，然后快速扩散到整个植株。其致病机理是产生大量的胞外多糖以堵塞到管系统从而阻止植物水分的输送。在模式菌株GMI1000，三个胞外蛋白PopA1，PopB和PopC已经被鉴定出来。PopA1，是一个通过三型泌出系统分泌到胞外的蛋白，同时缺少N-末端92个氨基酸的PopA1衍生物PopA3也已经从生长在营养贫瘠培养基的上清液中纯化出来。PopA1和PopA3均能引起矮牵牛花的过敏性反应。popA位于青枯菌hrp基因簇上游2kb，其表达受hrpB基因的调控。Arlat小组从青枯菌的基因组中发现了新蛋白PopB和PopC，PopB蛋白由173个氨基酸组成，含有两个核定位信号；PopC长1024个氨基酸，其中含有22个亮氨酸拉链。popB，popC，以及popA都是同时受hrpB调控的.在刚果红的诱导下，他们发现PopB和PopC是通过Hrp系统分泌到胞外的。

本发明从青枯菌中克隆到一个新的Harpin蛋白PopW，并对其特点进行了分析。该蛋白类似E.amylovora的HrpN，HrpW以及青枯菌的PopA，能够在烟草上引起过敏性反应，在温室条件下，能诱导烟草抗烟草花叶病毒的侵染。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于公开一种青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程应用，属于基因工程领域，该基因能诱导烟草抗烟草花叶病毒的侵染，提高植物抗病能力，从而进行生物农药的研发。

技术方案

1)popW基因的克隆

青枯菌ZJ3721在30℃条件下培养于MBG培养基，待菌株生长到对数期，按照细菌基因组提取试剂盒操作说明提取青枯菌基因组DNA；

设计扩增popW基因引物popW1：

上游引物F：CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGC  Nde I

下游引物R：GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG Hind III

或扩增popW基因引物popW2：

上游引物F：ATG TCC ATC CAG ATTGATCGC

下游引物R：GCCCGAGTAGGCCTTGTAG

或扩增popW基因引物popW3：

上游引物F：TCTAGAATGTCCATCCAGATTGATCGC  Xba I

下游引物R：GGATCCGCCCGAGTAGGCCTTGTAGCT  BamH I

以基因组DNA为模板，使用高保真pfu聚合酶扩增PopW的编码区序列，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃ 10min，产物切胶回收；

2)PopW蛋白的表达及纯化