[发明专利]高活性蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种高活性蜡样芽孢杆菌的培养和 保护方法。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus.cereus简称B.cereus)在自然界分布广泛，常存 在于空气、尘埃、土壤、水及植物中，有时正常人的粪便中也能检出。蜡样 芽孢杆菌在医药工业上主要制成微生态制剂，用于胃肠道疾病的防治、降血 脂、抗衰老、防止细菌移位、抗肿瘤及自身免疫性疾病防治，能起到“已病 治病，未病防病，无病保健”以及延缓衰老、延年益寿作用。在畜禽养殖业 和水产养殖业中，蜡样芽孢杆菌作为饲料添加剂得到了广泛的应用。如在仔 猪饲料中加入蜡样芽孢杆菌饲料添加剂能提高仔猪的机体免疫能力，降低仔 猪下痢发病率，同时能促进仔猪生长；蜡样芽孢杆菌制剂的使用同样能提高 鱼、虾、贝类等的产率、增重率，降低发病率和死亡率。

蜡样芽孢杆菌制剂能发挥这些作用，主要是通过其所含活菌的积极生命活 动而达到调节宿主微生态平衡的，因此其中活菌含量的高低始终是评定产品 质量的一项关键指标。然而，目前芽孢杆菌制剂普遍存在产品有效期不长、 货架期短的问题，当前所见报导就是通过干燥过程中减小压力来解决。由于 少数蜡样芽孢杆菌是日常食物中的污染源，国内外众多学者对能产生有毒物 质的蜡样芽孢杆菌进行了研究。Ynte P.de Vries等通过关键因子的基因暂时 表达研究了Bacillus cereu ATCC14579在特定条件下的生长和芽孢形成情况， 并探讨了谷氨酸盐的加入对菌的生长、芽孢形成及孢子特性的影响，发现谷 氨酸盐能加速芽孢完全形成，也有研究表明：蜡样芽孢杆菌在芽孢形成过程 中将谷氨酸盐作为主要能量来源，而且它对芽孢杆菌属的芽孢形成及芽孢特 性有很大影响。此外，一些表面活性剂的加入有助于发酵产物的分泌，如 Tween20能增加Bacillus cereus APS的环状多肽的产量，Tween80的加入能增 加Bacillus thuringiensis的细胞和芽孢浓度。

保护剂在微生物冻干保存过程中应用较多，为防止在冻干过程中蛋白质或 细胞的损伤，常通过添加糖、蛋白质、氨基酸等物质，在冷冻干燥过程中保 护活细胞，作为支持物和受体在复水过程中为干物质提供一定的骨架结构， 可使微生物细胞的成活率接近99.18％。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性蜡样芽孢杆菌的培养及保护方法，以提 高活菌存活率，延长产品保质期。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

高活性蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方 法，包括菌种活化、种子培养和发酵培养步骤；其中发酵培养基主要包括5～20 g/L碳源、4.0～11.0g/L氮源和无机盐，其pH值为6.0～9.0；在发酵培养过程 中还加入0.1～0.9g/L海藻糖，海藻糖的加入量优选为0.3～0.6g/L。

菌种活化时的培养基可采用一般的活化培养基，但为了更适应Bacillus cereusCMCC63305菌的活化，本发明经过大量实验优选为(g/L)：牛肉膏 4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，琼脂10～30，NaCl 4.5～5.5，pH 6.0～9.0，其余为 H₂O；进一步优选为：牛肉膏4.5～5.5，蛋白胨9.0～11.0，琼脂10～30，NaCl 4.5～5.5，pH 6.0～9.0，其余为H₂O，121℃灭菌。菌种活化时，将菌种接入有 菌种活化培养基的平板中，30～40℃培养24h。

种子培养时的培养基可采用一般的种子培养基，但为了更适应Bacillus cereusCMCC63305菌的培养，本发明经过大量实验优选为(g/L)：牛肉膏 4.0～6.0，蛋白胨7.0～11.0，NaCl 4.5～5.5，pH 6.0～9.0，其余为H₂O。种子培 养采用一般的工艺条件，而实验室的小试方法为：于平板取一环单菌落，接 入装有100mL培养基的500mL三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以 150～200r/min，30～40℃培养24h。