[发明专利]麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及齐墩果酸相关基因——β-amyrin合成酶基因GsAS1及功能验证。

背景技术

植物次生代谢是指有些生物体利用某些初生代谢产物为“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质的过程，这些特殊的化学物质即为次生代谢产物，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等，它们是植物中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物，但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展却起着不可替代的作用。

植物次生代谢产物具有重要的经济价值。临床应用的药物，有很多都是取自植物的次生代谢产物。西方的临床药物中，大约25％是直接或间接地从植物中提取的次生代谢物。在我国，药用植物的应用历史更为悠久。此外，用作食品调味剂、日用芳香剂、杀虫剂等的植物次生代谢产物也倍受人们的青睐。

随着基因工程技术的不断完善，对植物细胞代谢网络进行修饰和改造来积累大量目的产物已成为可能。目前，次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。应用关键酶基因的代谢工程为提高植物组织、细胞培养及整体植株代谢产物的产量提供了技术平台。

植物次生代谢产物种类繁多，生物合成途径也千差万别，只有在了解目标植物特定次生代谢途径的基础上，才能有选择地进行有效的基因操作。因此，植物次生代谢图谱的研究是植物次生代谢基因工程必要的前提工作。

植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。现在，已知大约有10000种次生代谢物，包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物三大类。萜类化合物(terpenoids)是植物次生代谢产物中最大的一个家族，在自然界中广泛分布，由异戊二烯(isoprene，C5)单元组成的化合物及其衍生物，按碳原子的数目可以分为单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和多萜等。由于多数萜类化合物分子中具有不同的碳环数，因此又可分为链萜、单环萜、双环萜和三环萜等。其中三萜类化合物是由六个异戊二烯单元组成的物质。广泛存在于动植物体内，以游游离状态或成酯或苷的形式存在。多数是含氧衍生物，为树脂的主要成分之一。例如甘草中的干草苷称为甘草酸，因其味甜又称甘草甜素，在酸性条件下水解得到的苷元称为甘草次酸，可溶于乙醇和氯仿中，是一个五环三萜化合物。角鲨烯是存在于鲨鱼的鱼肝油、橄榄油、菜籽油中的一个链状三萜，它是由一对三个异戊二烯单元头尾连接后的片段互相对称连接而成，具有降低血脂和软化血管等作用，被誉为血管清道夫。

中草药是中国传统的药用植物，其有效成分绝大多数都来源于次生代谢产物，在植物中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量难度很大。通过次生代谢的基因工程，来提高中药材有效成分含量的研究刚刚起步。有效成分相关基因的克隆及其功能鉴定的有效方法还较少，且耗时，所获得的次级代谢途径中的相关基因较少。

高寒藏药麻花艽系龙胆科(Gentianaceae)、龙胆属(Gentiana)，主要分布于西藏、青海、甘肃海拔2500-4700米的高寒地区，多年生草本，全草及根入药，由于其分布散，生长期长，药材收集极为困难，因而已成为濒危物种。主治黄胆性肝炎，风湿关节痛、结核病潮热、哮喘、抽搐、休克、过敏反应。富含五环三萜类次生代谢物，β-amyrin(β-香树素)是其中的一类重要的三萜类化合物。

β-amyrin是植物中最常见的三萜类化合物之一。它的五碳环骨架，折叠为椅式构象，是由2，3-氧化角鲨烯经过一系列反应在β-amyrin合成酶催化下形成的(Kushiro et al.，1998)。而其合成酶是该途径中非常重要的限速酶，控制着这些药用成分前体合成的第一步反应，因此对该基因的克隆具有极其重要的意义。齐墩果酸是该反应中的最终产物，在龙胆科植物麻花艽中β-amyrin合成酶基因对于抗肝炎有效成分齐墩果酸的积累具有很高的促进作用。

到现在为止，已从许多双子叶植物中分离到了β-amyrin合成酶基因，如双子叶人参中的PNY1(Kushiro et al.，1998)，PNY2(Kushiro et al.，1998)；干草中的GgbAS1(Hayashiet al.，2001)；豌豆中的PSY(Morita et al.，2000)；还有截形苜蓿(Suzuki et al.，2002)和白桦(Zhang et al.，2003)等：单子叶植物燕麦中的AsbAS1(Haralampidis et al.，2001)。并有文章报道对其功能的验证。对于