[发明专利]重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用

权利要求书

1.重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)、编码FIP-fve基因的克隆：取干燥金针菇菌丝体在液氮研磨后，加入 DNA提取液，获得基因组DNA，根据GenBank中已登录的Accession P80412 的FIP-fve蛋白质序列设计PCR引物，在引物上游加入ATG以便增强重组免疫 蛋白的表达效率和准确性；

(2)、重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建：将克隆的目的基因与载体 pPIC9一起经过酶切，回收和连接，然后转化至大肠杆菌中，提取质粒 pPIC9-FIP-fve；

(3)、重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得：将上述构建好的重组酵母表达 载体pPIC9-FIP-fve用BglII酶切线性化，采用电转法将目的基因转入酵母GS115 中表达，经转化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的选择培养基MD上，28℃至少 培养3天分别挑至MM和MD培养基对比，提取转化子酵母的总DNA；

(4)、重组FIP-fve的诱导表达和纯化：选取正确的酵母转化子，首先用摇 瓶500-1000ml振摇培养诱导重组蛋白表达，确定其有表达后，挑选其中表达量 高的酵母菌进行5L发酵罐大量培养，发酵上清经透析后SDS-PAGE检测，并 用君意凝胶分析系统测定目的蛋白产量，摇瓶发酵的产量至少为158.2mg/L， 5L发酵罐的产量为300mg/L～350mg/L，样品进一步通过超滤系统超滤浓缩， 4℃的低温透析后用血细胞凝集实验确定其活性，并进行DEAE-A25离子柱层 析纯化，再进一步用高效液相色谱进行纯化，收集具有生理学活性的目的蛋白， 最后检测重组FIP-fve的纯度；

步骤(1)所述的设计PCR引物为：上游，5`-ca gaattc atg tcc gcc acg tcg ctc  acc-3`；下游，5`-ag gaattc ggatcc tca agt ctt ctt cca ctc agc-3`。