[发明专利]在不使用对照细胞的情况下测量细胞活力的方法

说明书

本申请要求2007年11月9日提交的美国专利申请60/986,751号的优先权，其全部内容通过引用包含于此。

本发明涉及如下领域：细胞生物学以及细胞培养和组织工程。更具体而言，本发明涉及通过检测蛋白质或酶活性来测量所培养细胞的活力的方法。

组织工程(见Langer和Vacanti，Science，260：920-926(1993))领域关注于对基质或支架的使用以支持细胞的生长和维持。例如，基质诱导自体软骨细胞移植(移植)是用来修复软骨的第二代自体软骨细胞移植(ACI)方法。在移植中，将培养扩增的软骨细胞接种到胶原基膜基质上，此后便于外科移植。移植可以用于通过关节镜检查或者通过微创手术来治疗软骨缺损。

组织工程化产品中对基质的使用对试图测量工程化产品组成细胞活力的研究者提出重大挑战。现有的测量细胞活力的方法有赖于活细胞两个特征中的至少一个特征：呈现出完整质膜和/或其代谢活性。在体外，细胞的死亡伴随着失去质膜的完整性。使用活体染料在显微镜下可以容易地观测到这种现象。在最常用的活体染料化验中，将染料台盼蓝添加到细胞的悬浮液中。染料无法进入膜完整的活细胞，但使膜破损的死亡或正在死亡的细胞着色。可替选地，可以通过测量细胞代谢活性的一个或更多个标记来评定细胞活力。一个这样的方法是：对在活细胞中存在但在死亡细胞中枯竭或不存在的主要代谢物(例如，ATP、NADH)进行量化。补充方法是：对从膜受损细胞释放出的特定酶活性进行化验。例如，Cytox-Fluor细胞毒性化验(Promega，麦迪逊市，威斯康星州，Cat.No.G9260)使用内部淬灭荧光肽底物双-(丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰)-罗丹明-110(bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110)来检测从死亡细胞释放出的蛋白酶，诸如三肽基肽酶。

在应用于组织工程化产品时，大多数现有细胞活力检验需要在检验之前分离(收回)细胞。然而，分离过程常常是复杂的，有时是苛刻的，从来不是100％有效的。在该过程中，随着活细胞失去或被杀死，或者，随着死亡细胞失去，会出现测量人为因素。例如，在通过台盼蓝拒染法进行评估时，所收回细胞的活力总是接近100％，这未能反映出获得收回细胞的原始样本的真实活力。由于基质干扰、非特异性结合、检测的上限低、范围不够，或者在不同培养基类型中的精度低，在不首先收回细胞的情况下使用基于代谢活性的活力检验的尝试同样是不成功的。此外，现有的基于代谢活性的细胞活力检验都有根本的缺点，即，为了测量测试样本的活力，需要细胞数量和活力已知的阳性和/或阴性对照。为了做出有效的比对，对照和测试样本中使用的细胞必须是来自同一供体或同一株的同样类型的细胞，还必须具有同样的代谢轮廓(metabolic profile)。此方式不能应用于如下这些组织工程产品：其中，接种在3维基质中的细胞常常得到与生长在悬浮液中或2维表面上的同样的细胞非常不一样的代谢概况。另外，在每天的活力和质量控制中检验大量批次的工业生产实践中准备适当的对照以及获得额外的细胞常常是不实际的。

所移植细胞的活力在采用组织工程化产品的成功治疗中仍然是关键的决定因素。鉴于现有活力检验的缺点，需要容易、迅速且准确的方法以测量组织工程化产品中细胞的活力。这种方法需要在大范围细胞密度上、采用许多不同的细胞类型、培养基和基质进行操作。此外，这种细胞活力方法在无需对照细胞群的情况下有利地进行操作。

本发明提供了用以在各种情况下并且无需对照细胞而容易、快速、准确地测量细胞活力的方法。这些方法部分地基于这样的发现：所培养组织工程化产品中细胞的活力可以通过检测培养物上清液中所呈现培养细胞的一个或更多个酶活性的比率来确定。

为了本发明的目的，所理论化但不局限于的方面是，在伴随细胞死亡而失去膜完整性时，在细胞培养上清液中由质膜正常限制的细胞的内含物变得可检测。本发明的方法有赖于对细胞死亡稳定蛋白质或酶(即，可以检测其是呈现在活的还是死亡细胞中的蛋白质或酶)的检测。然后可以通过检测细胞死亡稳定蛋白质或酶在不含细胞的条件培养基(例如，上清液、或者支持基质或支架)中与在含有细胞的条件培养基(例如，膜完整的细胞以及相关联的条件培养基)中的相对量来确定培养物的细胞活力。仅在含有细胞的条件培养基的细胞中的细胞死亡稳定蛋白质或酶的量可以通过这样的方式确定：破坏膜完整细胞的膜完整性(例如，部分或完全裂解)、测量含有细胞部分(即，破损细胞以及相关联的条件培养基)中总的酶活性，并且然后减去由相关联的条件培养基贡献的任何酶活性。通过对无细胞条件培养基进行检验来测量所减去的值。