[发明专利]组织工程皮肤培养及增殖活力的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织工程皮肤培养及增殖活力的检测方法。

背景技术

组织工程皮肤可用于皮肤创伤如损伤、烧伤等后皮肤的移植、美容换肤及一些严重的皮肤病的治疗，有着广泛的应用前景和潜在的发展空间(Ehrenreich M，Ruszczak Z.Update on tissue-engineered biological dressings.Tissue Eng，2006，12：2407-2424.)。在组织工程皮肤培养过程中，保持种子细胞的增殖活力是皮肤发育的关键，也是判定移植后皮肤能否存活的重要参考依据。因此，为了促进组织工程皮肤细胞的增殖活力，人们不断探索适当的培养条件并在培养基中添加各种生物成分，如牛垂体提取物、重组人表皮生长因子(hEGF)等，以便预期得到足够量的皮肤用于临床实际应用(Poumay Y，Dupont F，Marcoux S，et al.A simple reconstructed humanepidermis：preparation of the culture model and utilization in in vitro studies.Arch Dermatol Res，2004，296(5)：203-211.)。为此，在组织工程皮肤培育过程中掌握和了解组织工程皮肤的增殖能力和活力，对于判断和凭估组织工程皮肤培养条件及培养基营养成分，以便及时进行适当干预和调整有重要的实际应用价值和意义。

目前在生物医学领域用于细胞增殖的标记物主要有Ki67，PCNA(Proliferating cellnuclearantigen)及Brdu(5-bromo-2--deoxyuridine)等。以往在细胞生物学研究中人们常采用同位素标记，但同位素存在放射污染，技术难度大，实验周期长等缺点，使实验应用受到限制。国外Gibbs S等用Ki67对体外培养的皮肤组织进行增殖活力的观察(Gibbs S，SilvaPinto AN，Murli S，et al.Epidermal growth factor and keratinocyte growth factordifferentially regulate epidermal migration，growth，and differentiation.WoundRepReg2000；8：192-203)。我们也曾用同样方法对体外培养的皮肤组织进行增殖活力的研究(陆洪光等，中华皮肤科杂志2005；38(12)：738—741.)。Ki67不失为一种清晰标记的核抗原，但是在实际应用中，需要终止皮肤组织培养，然后再进行Ki67的检测。Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，能被S期细胞摄入，代替胸腺嘧啶在DNA合成期掺入DNA中，因活体组织细胞内无内源性Brdu存在，所以人们常用Brdu结合抗Brdu单抗标记检测活体组织细胞，以判断其增殖活力。自1982年Gratzer制备出抗Brdu单抗及标记检测技术不断改良提高，应用Brdu标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)相似。目前Brdu作为增殖细胞标记物得到广泛应用(Kormack DR，Pakic P.Cell proliferation without neurogenesis in adult primateneocortexScience.2001；294：2127--30.)。然而，由于Brdu是外源性细胞标记物，若对整个培养的组织工程皮肤加入Brdu后检测其增殖性，会干扰和影响皮肤组织的生长发育，并且由于活组织的BrdU标记可能会带来组织工程皮肤质量、及后来用于人体皮肤移植的安全性会有影响，因此找出一种理想的、既能客观检测组织工程皮肤增殖活力又不影响皮肤生长的方法十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种组织工程皮肤培养及增殖活力的检测方法，以克服现有技术存在的干扰和影响皮肤组织的生长发育的不足。