[发明专利]一种凝结芽孢杆菌及高密度培养的芽孢制剂的制备及其应用

权利要求书

1.一株凝结芽孢杆菌菌株，其分类命名为：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JSSW-LA-07，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2602；该菌株JSSW-LA-07在有氧条件下能够产芽孢，并在发酵过程中代谢产出少量L-乳酸；在静置厌氧条件下能够产出纯度较高的L-乳酸。

2.一种权利要求1所述凝结芽孢杆菌的高密度芽孢制剂的制备方法，其特征是通过以下步骤来完成：

(1)斜面菌体活化

无菌开启菌株JSSW-LA-07的冻干保藏菌种，划线接种于麸皮营养琼脂试管斜面，斜面培养基组成以g/L计为：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，麸皮10，琼脂15-20，pH 7.0-7.2；30-60℃培养24-48h；然后划线转接于麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，30-60℃培养24-48h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种；

(2)摇瓶及种子罐培养

准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液，将菌悬液在80℃水浴中加热10分钟，以体积比1％-10％的接种量接入250mL三角瓶，装液量为15mL；或500mL三角瓶，装液量为30mL；摇瓶培养，或接入种子罐培养，种子罐体积选用10L、20L、50L或100L，种子罐的装量系数体积比为60％-70％；

培养基组成为以g/L计：麸皮5-20，酵母膏5.0-10，豆粕粉5-10，K₂HPO₄3，NaCl5，MnSO₄·H₂O 0.3，pH 7.0；

培养条件为：摇瓶转速200r/min；种子罐搅拌转速≥150r/min，通气量1-2m³/h，培养温度为30-60℃，培养时间为18-48h；

(3)发酵罐培养

种子培养液以体积比1％-10％的接种量接入发酵罐，发酵罐选用1T、2T、或3T体积的发酵罐，发酵罐装量系数体积比为60％-70％；

发酵罐培养基组成：

发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/L计：碳源5-20，氮源5-20，K₂HPO₄ 3，NaCl 5，MnSO₄·H₂O 0.3，碳酸钙2-10，pH 6.0-8.0；

发酵罐培养条件为：搅拌转速≥150r/min，通气量1-2m³/h，培养温度为30-60℃，培养时间为18-48h；在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染；取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养；取样测总菌数及芽孢数；

活菌及芽孢检测用番茄汁琼脂计数培养基以g/L计：酵母膏10，蛋白胨10， 番茄汁200mL，CaCO₃ 5，琼脂15-20，蒸馏水800mL，pH 7.0-7.2；测得发酵液芽孢数量达1×10⁹cfu/mL以上；

(4)芽孢收集及菌粉制备

将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀粉以重量比1:1-5混合，在40-50℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入配料石粉、麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，混合后制成微生态制剂，芽孢含量达1×10⁹cfu/mL以上。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是凝结芽孢杆菌液体发酵的碳源和氮源的选择十分广泛，碳源选用麸皮、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、玉米糖、大米糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉或马铃薯淀粉中的一种或几种；氮源选用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆粉、豆粕粉、大豆肽、棉籽蛋白、黄豆饼粉或花生饼粉中的一种或几种。