[发明专利]一种三聚氰胺人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种三聚氰胺人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

三聚氰胺(Melamine，MM)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于塑料、涂料、皮革等行业。三聚氰胺在一般情况下较稳定，但在高温时会分解释放出氰化物，因此，采用三聚氰胺制造的器具均需标明“不可放进微波炉使用”。此外，三聚氰胺还可用作阻燃剂、粘合剂、甲醛清洁剂等。通过水解作用，三聚氰胺可以转化为三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸三酰胺和三聚氰酸。美国FDA研究表明，三聚氰胺与钙在体内尿pH维持下形成不溶解的复合物，导致尿结石和膀胱癌，对人体造成巨大损害。由于目前在食品尤其是奶制品中测定蛋白质含量主要是通过“凯氏定氮法”测出含氮量从而估算其蛋白质含量，三聚氰胺分子含氮量高达66％左右，在奶品中添加三聚氰胺会增加其蛋白质含量的测试值，且成本低廉，利润巨大，所以三聚氰胺常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，例如我国三鹿奶粉事件，因此三聚氰胺也被人称为“蛋白精”，为此我国在2008年10月7日卫生部等五部门联合发布公告，确定了三聚氰胺在乳与乳制品中的检测限量值。目前我国对三聚氰胺检测有三种方法，即高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)，但这三种方法均需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，已不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。近年来，国外已经开展了对三聚氰胺免疫分析方法的研究，但国内尚没有此方面的报道，为弥补这一空白，有必要制备三聚氰胺人工抗原。

发明内容

针对现有检测技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种三聚氰胺人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于食品中三聚氰胺含量及免疫检测上，具有检测快速、操作简便、成本低的优点，为今后的研究提供方便的途径。

本发明的技术方案：一种三聚氰胺人工抗原的制备方法，以三聚氰胺为半抗原，利用其结构中原有的氨基，通过戊二醛使半抗原和牛血清蛋白发生结合，制备三聚氰胺的人工抗原，即三聚氰胺-牛血清蛋白。其反应方程式为：

工艺步骤为：

1、人工抗原的制备

(1)制备A液：称取13mg的半抗原于25mL烧杯中，加入含质量浓度50％甲醛的pH 7.2的磷酸盐缓冲液4mL，在室温磁力搅拌下至充分溶解后，逐滴加入质量浓度25％的戊二醛12mL，在室温磁力搅拌下反应3h，此液为A液；

磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠10.9g，磷酸二氢钠3.2g，氯化钠90g加蒸馏水至1000mL，调节pH至7.2，室温储存，用时稀释10倍即为工作液；

(2)制备B液：称取10mg的牛血清蛋白溶于pH 9.6、0.05mmol/L的碳酸盐缓冲液2mL中，低温保存，此液为B液；

碳酸盐缓冲液：称取碳酸钠1.08g，碳酸氢钠2.95g加蒸馏水至1000mL，调节pH至9.6，室温保存；

(3)在室温磁力搅拌下，将B液缓慢滴加到A液中，并在搅拌条件下继续反应3h，期间分两次共加入2mL的磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原混合液；

(4)将人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析3-4天，每天更换2次磷酸盐缓冲液；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：三聚氰胺-牛血清蛋白。

透析袋的预处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，然后将其放入去离子水中分别煮两次，每次10分钟，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

2、三聚氰胺人工抗原的鉴定：采用紫外分光光度法测定偶联比。

本发明的有益效果：所制备的产品可用于食品中三聚氰胺含量及免疫检测上，具有检测快速、操作简便、成本低的优点，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明

图1  三聚氰胺人工抗原制备前后的紫外扫描图。

具体实施方式

1.人工抗原的制备

(1)制备A液：称取13mg的半抗原于25mL烧杯中，加入含质量浓度50％甲醛的pH 7.2的磷酸盐缓冲液4mL，在室温磁力搅拌下至充分溶解后，逐滴加入质量浓度25％的戊二醛12mL，在室温磁力搅拌下反应3h，此液为A液。