[发明专利]肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白

权利要求书

1、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于：将合成的胃癌血管特异性结合的小肽GX1与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下：

GAA TTC ATG TGT GGT AAT TCT AAT CCT AAG TCG TGC GGA TCC CGCAAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGGCAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AATGGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGCCTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCCTCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCCTAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAGAGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCCATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGCGCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAGGTC TAC TTT GGGATC ATT GCC TTC TGA CTG CAG

2、根据权利要求1所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其制备方法是：

1)合成含有酶切位点的小肽CGNSNPKSC(GX1)；

2)GX1-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；

3)重组蛋白的诱导表达；

4)重组蛋白的纯化；

5)重组蛋白的体外生物学活性检测；

6)重组蛋白的体内生物学活性检测。

3、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的GX1-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建中pBV220-rmhTNF质粒，它的克隆位点是EcoR1，BamH1和Pst1；按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GX1导向肽的含有酶切位点的核酸片断：5＇AATTC ATGTGT GGT AAT TCT AAT CCT AAG TCG TGC G3＇

将合成的片断于93℃变性10min，退火，再与用EcoR1和BamH1处理过的pBV220连接。

4、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的重组蛋白的诱导表达，将重组好的质粒转化感受态工程菌大肠杆菌DH5 α细胞，随机挑选克隆，以EcoR1和Pst1双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30℃活化振摇培养12小时，次日以1∶100比例接种LB(含Amp100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD_650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h；3000rpm离心15min收集菌体。