[发明专利]一种固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器的制备方法，特别涉及一种固定乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备方法。

背景技术

有机磷农药在世界农业生产中有着不可替代的作用。随着WTO的加入，我国与其他国家农产品的贸易额逐年增加，进口国对农产品的质量提出越来越高的要求。为了提高我国农产品的安全质量，增强国际竞争力，我国政府对农药残留问题十分重视，大力发展农药的速测技术，加强对农产品的实时监测。加强农产品中农药残留的检测与控制已成当务之急。

国际上农药残留分析常用的是色谱法、色谱-质谱联用法等，但是由于仪器复杂、昂贵、操作繁琐，常需要液-液萃取或固-液萃取等前期处理过程，难于快速使用。针对我国当前的国情需要开发在常温下的速测技术，及时确保上市农作物的食用安全。

八十年代，蔬菜农药快速检测技术在国外一些国家已经广泛使用。近年来，我国一些省市的蔬菜批发市场、蔬菜生产基地等也开始使用速测法检测，但其检测原理均采用光电比色法，这类仪器检测灵敏度较低，有的农残检测达不到国际或国内最低检测限标准，不利于进一步推广普及。

近年来，随着生命科学和环境科学等领域的迅速发展，以生物材料为基础的各种生物传感器的开发应用越来越受到关注，乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器应用于有机磷农药的检测就是其中之一。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是一种能够选择性催化底物乙酰胆碱水解的酶，在动物体内普遍存在。有机磷农药是AChE的抑制剂，能使体内AChE活性明显降低。利用有机磷农药对AChE活性的抑制，可测定环境样品中有机磷农药的含量。测定AChE活性的重要方法之一是AChE生物传感器法。其中安培型AChE生物传感器的原理为：AChE催化底物乙酰硫代胆碱(acetylthiocholine，ATCh)水解，生成硫代胆碱和乙酸，其中，硫代胆碱具有电化学活性，能在电极上产生氧化还原电流，在一定条件下该电流的大小可间接反映AChE的活性。

碳纳米管修饰电极具有很好的电化学稳定性、良好的导电性、大比表面积以及优良的电催化性能，能促进电活性物质的电子传递等优点。目前，碳纳米管被用来作为电活性材料和电活性材料的载体已广泛应用于电化学和生物传感器中，但将先电沉积后再层层自组装来固定化酶，特别是应用于固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器对对硫磷的检测研究目前还尚未见报道。

发明内容

为了解决有机磷农药残留在常温下，响应敏捷，稳定性好的的速测技术，开发了一种固定化乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器。

本发明采用的技术方案

本研究根据等电点的大小使酶带上电荷，然后与带相反电荷的碳纳米管修饰层以静电吸附的形式相互作用进行固定，构建了基于多壁碳纳米管和聚二烯丙基二甲基氯化铵层层自组装的乙酰胆碱酯酶传感器，并将其应用于有机磷农药对硫磷的实际检测。

首先是利用电沉积技术将带有负电荷的碳纳米管沉积到玻碳电极表面，随后在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液和碳纳米管分散液中进行层层静电自组装过程，得到自组装效率高、修饰层稳定的修饰电极。然后，在聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液和胆碱酯酶的PBS(磷酸盐缓冲液)溶液中再进行层层自组装，得到稳定性较高的固定化乙酰胆碱酯酶电流型化学生物传感器。

其具体的制备步骤如下：

(1)玻碳电极经过抛光、在pH5.00～8.00的磷酸盐缓冲液中循环伏安扫描10圈进行电化学活化预处理后，与铂电极组成两电极系统电沉积2小时，形成亮黑色的带有大量负电荷的碳纳米管电沉积层；

(2)将步骤(1)中经过电沉积后的玻碳电极浸入到离子强度为0.8mol·L^-1的1％的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，进行聚二烯丙基二甲基氯化铵的静电自组装，10～15min后取出用去离子水仔细冲洗2min，再浸入到pH7.0～10.0的四硼酸钠溶液作为分散剂的浓度为0.5～1.5g·mL^-1碳纳米管的分散液中，进行碳纳米管的静电自组装，15min后取出，用去离子水小心冲洗2min，至此，碳纳米管修饰层为1层，反复操作，直到碳纳米管的修饰层层数为5，最后，将得到的最外层为多壁碳纳米管的电极在红外灯下烘干；