[发明专利]以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法

权利要求书

1.一种以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，rhDSL重组蛋白的制备：首先构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL，挑取转化有pQE30-hDSL质粒的DH5α的单菌落，25～30mL含100μg/mLAmp的LB培养基，37℃振荡培养过夜；次日将过夜菌液按2％的接种量转接到1L～2L的含100μg/mL Amp的LB培养基内，转接后37℃培养2.5～3.0h左右，待OD600＝0.6～0.8的时候停止培养，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4h，收集菌体，用30mL预冷1×PBS洗涤菌体，收集的菌体用30mL预冷Sonicate buffer重悬，经超声裂解和100μg/mL的溶菌酶裂解细菌后，高速离心，收集沉淀包涵体，每克包涵体用18mL Pellet Wash Buffer洗涤3次；

洗涤后的包涵体用Buffer/Urea变性，离心取上清，将上清缓慢滴加到10倍体积的复性液Alkaline Buffer A内，再将复性液同体积的稀释液缓慢加入复性蛋白液中；

用Wash Buffer平衡Q Sepharose阴离子柱后，将复性后的上清过柱纯化，用elution buffer梯度洗脱，得到初步纯化的rhDSL重组蛋白，之后采用金属离子Ni²⁺亲和层析纯化，用1×His-Tag Binding Buffer平衡金属离子Ni²⁺，将阴离子交换层析后所得蛋白溶液过柱纯化，用1×His-Tag Elution Buffer洗脱目的蛋白，得到纯度＞99％的rhDSL重组蛋白；

所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL是指：以重组质粒pGEX-2T/hDSL为模板，PCR的方法扩增hDSL基因片段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸，共298bp，割胶回收后的PCR目的产物和含6×His标签的原核表达质粒pQE30经限制性内切酶HindIII、BamH I双酶切，连接割胶回收后的酶切产物，并将连接产物转化到预先制备的DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突变且读框正确；

所述的rhDSL重组蛋白为含有6×His标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽，所述的衍生多肽由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为：LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI；

所述的Sonicate buffer为含1mM EDTA，5mM DTT，0.1mM PMSF，pH7.3的PBS；

所述的超声裂解为中等程度超声，每次超声30sec、停30sec，共20次；

所述的Pellet Wash Buffer为含1％Triton X-100，10mM EDTA，50mMNaCl，100μM PMSF，pH 7.3的PBS；

所述的Buffer/Urea为8M urea，50mMTris-HCl，1mM EDTA，50mMNaCl，0.1mM PMSF，pH 8.5；

所述的复性液Alkaline Buffer A为50mM NaH₂PO₄，0.1mM PMSF，pH10.7；

所述的稀释液为20mM Tris-HCl，0.1mM PMSF，pH 8.0；

所述的Wash Buffer为20mMTris-HCl，pH 9.1；

所述的elution buffer为20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 9.1；

所述的1×His-Tag Binding Buffer为0.05M imidazole，0.5M NaCl，20mMTris，pH8.5；

所述的1×His-Tag Elution Buffer为0.2M imidazole，0.5M NaCl，20mMTris，pH 8.5；

第二步，在HS/PCs体外培养体系中加入上述制备的rhDSL重组蛋白及早期造血因子，采用这两者结合扩增造血干细胞和祖细胞。