[发明专利]一种真菌泛素交联酶活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及真菌杨树菇(Agrocybeaegerita)泛素交联酶基因序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽及其制备方法，同时还涉及多肽在医药、抗肿瘤中的应用。

背景技术

杨树菇(Agrocybe aegerita)隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属。又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇、柳松茸等。富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸高达1.75％，其营养价值超过香菇、金针菇等其他食用菌，同时又具有独特的药用价值，民间常用于抗癌、降压，治疗胃冷、肾炎、水肿等有独特疗效，有＂中华神菇＂之美誉，但其中的药理成分并不明确，本发明中涉及的杨树菇泛素交联酶是我们首次发现的重要药理成分。

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，UPP通路包括泛素、泛素激活酶(Ub-activating enzyme，E1)、泛素交联酶(Ub-conjugating enzymes，E2)、泛素连接酶(Ub-proteinligases，E3)、蛋白酶体(proteasome)复合体等。2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研究”中做出开创性贡献的三位科学家。泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是一些短寿命的细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物以及变性变构蛋白等。泛素化过程是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞的多种生理活动过程，比如细胞凋亡、MHCI类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等，对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。当泛素-蛋白酶体系统对靶蛋白的降解功能失常时，可以引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白异常降解、突变细胞凋亡受阻和增殖加速，从而导致肿瘤的发生。UPP的异常改变不仅与恶性肿瘤的病因学有着直接关素，并且与恶性肿瘤的发展和预后有着密切的关系。

在UPP通路中，蛋白酶体已经作为抗肿瘤药物的设计靶点，蛋白酶体抑制剂Bortezomib(Bz)已经实验和临床证明是一种有效的新的抗癌治疗药物，它抑制26S蛋白酶体活性，阻断UPP和诱导胱冬肽酶(caspase)活化，可以作为UPP研究的有利工具和具有潜在的抗肿瘤和抗炎作用。而UPP通路中的其他成分还没有作为抗肿瘤药物设计靶点的报道。

本发明中提供一种真菌来源的泛素交联酶，具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性，是UPP通路中针对E2组分的抗肿瘤活性蛋白。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种多肽核苷酸序列，该序列能编码上述杨树菇泛素交联酶多肽序列。该序列与SEQ ID NO.1中1-456位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中1-456位的核苷酸序列杂交。70％的同源基因可以通过突变试剂盒进行突变，或者通过插入，缺失等基因操作获得。较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中1-456位核苷酸序列编码具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该序列是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列，连接于表达载体，生产杨树菇泛素交联酶。

本发明的另一个目的在于提供一种真菌泛素交联酶活性的多肽(SEQIDNO.2)所示的氨基酸序列，该多肽具有多种活性：抗肿瘤活性，在医药上具有广泛的应用价值。该泛素交联酶是报道的第一个具有抗肿瘤活性的泛素交联酶。

本发明还涉及一种杨树菇泛素交联酶多肽的制备方法，该方法是构建原核表达载体，利用亲和层析方法纯化杨树菇泛素交联酶，该方法简便，成本低廉。

本发明还涉及一种真菌泛素交联酶活性的多肽(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列在作为制备治疗或预防宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤疾病药中的应用。它可以抑制多种肿瘤细胞的生长，杀死肿瘤细胞，对肿瘤细胞的抑制作用优于或类似于临床应用的化疗药物阿霉素效果，该泛素交联酶有开发成抗肿瘤药物的潜力。

为实现上述任务，本发明采用以下技术措施：