[发明专利]一种检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及生产米格列醇过程中检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的检测方法。

背景技术

米格列醇(miglitol)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病药物。它是从杆菌肉汤培养基中发现的一种新型肠道α-葡萄糖苷酶抑制剂，是1-脱氧野尻霉素的母体修饰产物，属于N-取代-1-脱氧野尻霉素类型，结构与葡萄糖相似。尽管用化学合成的方法能够制备米格列醇，但化学合成法制备米格列醇的步骤较多，米格列醇分子中含有的四个手性中心也给化学合成带来了很大的困难。目前生产规模大多采用生物合成来制备米格列醇。米格列醇的生物合成法据文献报道大致有二条路线：一是先由野尻霉素或1-脱氧野尻霉素产生菌生物发酵，制备获得野尻霉素或1-脱氧野尻霉素，然后再经过化学合成方法获得米格列醇，这是最原始的途径；二是应用氧化葡糖酸菌转化制备米格列醇关键中间体N-取代-1-脱氧野尻霉素，其主要通过化学合成-生物转化-化学合成的方法来制备。

US4266025，EP0477160，USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生产方法，即化学合成结合生物催化的方法。但由于菌体活力不高，导致生物催化时间过长，造成生产成本高，生产周期长，给工业化生产带来很大的障碍。

由于微生物酶的高效专一性，省略了化学合成过程中为达到专一地改造某个目的基团必须进行的加入和脱除保护基团的步骤，大大简化了制备过程，提高了反应收率。氧化葡糖酸杆菌用于转化特定底物制备1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有很多优点：1)转化液经离心除去菌体，无需分离纯化出中间体，就可进行下一步合成。2)无需基团保护，成本大大降低，且避免因去除保护剂而造成的回收率下降。3)中间体6-(取代胺基)-6-脱氧-α-L-山梨呋喃糖具有较高的溶解度和稳定性，不易被降解。但对于转化机理的报道还没有，可以肯定的是，葡萄糖氧化杆菌中含有参与该转化反应的生物酶或酶系，葡萄糖氧化杆菌的催化能力与其含有的生物酶系的数量和活力有直接关系。

目前还没有有关检验菌体催化能力的方法的相关报道，同样也没有关于葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法研究和结果判断方法的相关报道。

发明内容

在发酵生产米格列醇过程中，常常由于葡萄糖氧化杆菌的催化能力低下，导致最终的发酵单位低，生产成本高。为了避免种子的催化能力低下导致发酵成本高的风险，本发明提出一种检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法。根据此方法，判断菌体催化能力是否适合大生产需要，降低了生产中催化反应不完全的风险。

为了达到发明目的，发明人提出了检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法，包括摇瓶生物转化过程、硅胶板层析和显色过程。具体地，本发明的检测方法包括如下步骤：

1)将N-(2-羟乙基)-葡糖胺用纯化水溶解，加入葡萄糖氧化杆菌的菌丝体，放入恒温振荡培养箱中转化；

2)将转化液离心，取上清液点样硅胶板，以甲醇-乙醇-氨水为层析液进行层析，然后干燥硅胶板进行碘显色。

优选地，上述1)步骤中N-(2-羟乙基)-葡糖胺在水中的重量百分比浓度为2％～8％，pH为4.5～6.5，菌丝体与N-(2-羟乙基)-葡糖胺的重量比为1～5∶1，其转化的条件为：恒温振荡培养箱的转速为250rpm，温度为20℃，转化15小时；优选地，上述2)步骤中甲醇-乙醇-氨水的体积比为1～3∶1～3∶1～3，甲醇、乙醇、氨水都为分析纯，其中，氨水浓度为25-28％。

在具体应用过程中，可以选取具体实施方式中的某一实施例，对不同批次菌丝体的催化能力应用本方法进行检测、分析，如果某一批次菌丝体催化能力明显低于正常值，则说明本批次菌丝体发酵过程控制不当，不能用来做生产。本发明操作简单、易行，对生产、研究很有意义。既可以用于出发菌株的催化能力检测，优选菌株，又可用于发酵结束菌丝体的催化能力的检验，指导生产，极有应用价值。

具体实施方式

实施例1

(1)精确称量底物(N-(2-羟乙基)-葡糖胺)1.0克，放入500毫升摇瓶中，用49毫升纯化水溶解，使底物重量百分比为2％，以浓盐酸调节pH值至6.5，加入葡萄糖氧化杆菌的菌丝体5克，使菌丝体和所转化底物的重量比为5∶1，放入恒温振荡培养箱中，在转速为250rpm，温度为20℃的条件下，转化15小时。