[发明专利]毒死蜱和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原的制备

说明书

(一)技术领域

本发明属于残留农药检测领域，涉及一种适用于同时针对残留毒死蜱和甲基对硫磷进行分析的酶联免疫吸附测定试剂盒的毒死蜱和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原的制备。

(二)背景技术

农药及其代谢物传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁琐复杂，工作量大，仪器昂贵，并要有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及廉价的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的检测应用。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管将免疫分析用于农药残留分析的时间很短，仍然很快用于环境样品和食品样品中农药残留的分析。

毒死蜱(Chlorpyrifos)，自1965年由美国Dow公司开发推广后即作为一种广谱性高效杀虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、棉花等经济作物的多种害虫防治，并且对地下害虫、家畜害虫以及卫生害虫也有很好的防治效果。但是由于毒死蜱对人畜的毒性相当高，近年来，因毒死蜱中毒的报道，仍然屡见不鲜。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，对人体健康造成极大的危害，这已引起人们的关注。甲基对硫磷(Parathion-methyl)由1944年德国希拉台尔(G.Schrader)化学家首先合成，1949年拜尔公司首先建厂生产，嗣后世界各地大量有多家公司相继投产，上世纪60年代之后我国产、用量都很大。甲基对硫磷作为一种广谱性高效杀虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、棉花等经济作物的害虫防治。但是由于甲基对硫磷对人畜剧毒，因甲基对硫磷中毒的报道，屡见不鲜，目前我国虽然已经禁止生产和使用甲基对硫磷。开发一种简单快速同时适用于毒死蜱和甲基对硫磷农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。

检测毒死蜱和甲基对硫磷残留量常规方法为高效液相色谱法等。然而该方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，且该方法需要昂贵的仪器，且过程繁琐，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为毒死蜱和甲基对硫磷的残留检测提供了一个新的分析检测途径。目前的文献和专利公开了用于分析残留毒死蜱的酶联免疫吸附测定试剂盒或分析残留甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法，而现有技术中没有同时分析残留毒死蜱和甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法的技术。

本发明正是针对这一空白，经过发明人长时间的实验和测试，得到了适用于同时分析残留毒死蜱和甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定试剂盒的关键原料毒死蜱和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原的制备技术。使用本发明的毒死蜱和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原制备的同时分析残留毒死蜱和甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定试剂盒保质期不低于1年，对残留毒死蜱和甲基对硫磷在蔬菜中的最低检出浓度分别为12.0、10.0ng/ml。

(三)发明内容

【要解决的问题】

本发明的目的是提供一种毒死蜱和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原的制备技术。

本发明的另一目的是本发明所制备的毒死蜱和甲基对硫磷通用抗体及通用包被抗原可以用于制备同时分析残留毒死蜱和甲基对硫磷的酶联免疫吸附测定试剂盒。

毒死蜱人工半抗原、甲基对硫磷人工半抗原同时和牛血清白蛋白反应制备毒死蜱和甲基对硫磷通用人工抗原是本发明的重要特征之一。

毒死蜱人工半抗原、甲基对硫磷人工半抗原同时和卵清蛋白反应制备毒死蜱和甲基对硫磷通用包被抗原是本发明的另一重要特征。

【技术方案】

毒死蜱和甲基对硫磷通用人工抗原制备：毒死蜱人工半抗原、甲基对硫磷人工半抗原同时和牛血清白蛋白反应，同时发生如下两个反应：

操作步骤：计算量的人工半抗原、三正丁胺分别溶于DMF中的两混合物a和b，将b加于a中得混合物c。将溶解有氯甲酸异丁酯的DMF溶液于4℃滴加到c中，反应1小时得d。将计算量牛血清白蛋白溶于定量PH＝8.7、0.05M的硼酸盐缓冲溶液中，然后于18℃以下将d滴加其中，室温反应12小时。所得反应液装入透析袋，于PH＝7.4、0.01M缓冲溶液中4℃条件透析至透析液中检不出半抗原紫外吸收(OD₂₈₂)，精确量取透析后的蛋白质溶液体积，测定蛋白质浓度和结合比为40～50，分装，-20℃保存。