[发明专利]高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高活性果糖缬氨酸氧化酶。 

背景技术

血液中的糖化血红蛋白(以下简称：糖化Hb)反映了一段时期内生物体内的血糖水平，近年来被用作糖尿病的诊断和治疗的重要指标。目前，糖化Hb可采用高效液相色谱法、微柱法、免疫法、色素法等方法来测定，但这些方法或者需要专用仪器、价格昂贵，或者检测时间长、测量精度差，最近流行的酶法检测，利用氧化还原反应，不需要特殊的测定仪器，操作简便易行，精度高，时间短，因此广泛应用于生化分析和临床检查。 

利用上述氧化还原反应的糖化Hb的测定过程中，需要一类特殊的酶类——果糖基氨基酸氧化酶，该酶可作用于糖化Hb或糖化氨基酸，产生过氧化氢，然后添加过氧化物酶和还原剂，使过氧化氢和还原剂之间发生氧化还原反应，可通过测定还原剂的显色来测定过氧化氢量，从而可知样品中糖化Hb含量。 

然而，利用现有果糖基氨基酸氧化酶催化该反应，时间仍嫌稍长，酶量需求较高。所以要求开发新型高活性果糖基氨基酸氧化酶。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的高活性果糖缬氨酸氧化酶，其可用于糖化Hb试剂盒检测，所用酶量减少，反应时间缩短。 

本发明基于果糖缬氨酸氧化酶的编码序列，通过易错PCR技术，建立了果糖缬氨酸氧化酶的突变文库，将突变文库转入大肠杆菌，进行两轮筛选，得到了活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的新型高活性果糖缬氨酸氧化酶。该高活性果糖缬氨酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID.No.2的序列。 

本发明的一种编码高活性果糖缬氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示序列。 

本发明的高活性果糖缬氨酸氧化酶的制备方法步骤如下： 

(1)以Corynebacterium sp.2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库； 

(2)将突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达； 

(3)利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。 

随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。为此，人们利用酶的定向进化技术对天然酶进行改造，从而获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 

定向进化包括随机突变和筛选，其中随机突变应用较为普遍的技术是易错PCR突变，即通过调整PCR体系中的离子浓度，各种dNTP含量，引物和模板浓度，使用易产生突变的Taq酶，使用突变率高的菌株等方法，使PCR产物相对于模板产生许多点突变，从而改变蛋白的氨基酸序列。通过条件筛选，获得具有期望特性的目的酶。 

棒状杆菌属Corynebacterium sp.2-4-1菌株含有果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)的编码基因。本发明基于FVO的基因编码序列，设计两条FVO基因的易错PCR引物，上游引物序列为：5’-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3’，下游引物序列为：5’-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3’。以FVO的基因编码序列作为模板，进行易错PCR扩增，经扩增35个循环后，PCR产物纯化回收，与原核表达载体pMD-18T Vector连接，转化入大肠杆菌XL1-Red中，涂布LB平板，收集含有插入片段的克隆，组成突变体库。 

提取突变体库中的质粒DNA，酶切，回收目的片段，连接入载体pGEX-4T-1m，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺[DA-64]的LB平板，由于大肠杆菌自身含有过氧化物酶，故37℃培养12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养。