[发明专利]一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。

(二)背景技术

细胞移植治疗修复组织损伤是目前新兴的医疗领域热点。细胞疗法是对传统医学的一种补充手段，为某些难治性疾病的治疗提供新的希望。干细胞是一种能自我复制无限增殖，在特定的诱导条件下向同胚层或其他胚层细胞分化的祖细胞。根据不同组织来源，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，后者分布于大部分组织中。由于成体干细胞移植无伦理学问题和致瘤性，更适合于基因和细胞工程的“种子细胞”。间充质干细胞来源于中胚层细胞。可从很多组织分离获得，如肝脏、胎儿和脐带血、羊水和脂肪组织，但研究最多和最易得到的是骨髓(在全部骨髓单个核细胞占<0.01％)。

人骨髓间充质干细胞的鉴定主要包括：①在正常体外培养条件贴壁生长，呈长梭形或三角形；②流式细胞学检测95％以上的骨髓间充质干细胞表达CD105、CD73和CD90，且不表达CD45，CD34，CD14(或CD11b)，CD19(或CD79-α)，人白细胞抗原HLA-DR表面分子(小于2％阳性表达率)；③具有多分化潜能。大量动物实验显示骨髓间充质干细胞在修复组织损伤中有其独特的优势和良好的安全性，且人骨髓间充质干细胞移植能显著改善急性心肌梗死后心功能和延缓心室重构。进一步研究发现，移植的人骨髓间充质干细胞直接分化为心肌样细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，参与新生血管形成，更重要的是移植细胞通过旁分泌大量的细胞因子和生长因子，抗细胞凋亡和促血管新生，增加移植细胞的存活率。有研究认为，骨髓干细胞移植后能在局部存活增殖的仅占移植细胞的1/3，因为提高移植细胞在局部组织的存活率和旁分泌能力势必能提高细胞移植的疗效。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。

本发明采用的技术方案是：

一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，所述方法为：将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞缺氧培养20～30小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植。所述缺氧培养是指在没有氧气存在下进行培养，可在氮气、二氧化碳或者氮气与二氧化碳混合气的氛围下进行培养，除了气体氛围与常规培养不同外，其他培养条件均可参照常规人骨髓间充质干细胞的体外培养条件进行。

缺氧预处理能激发细胞内源性保护机制，启动某些基因的表达和应激蛋白的合成，增强细胞抗缺氧能力。研究发现，缺氧预处理(亚致死量)能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，包括缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，血管合成素-1，血管内皮细胞因子受体Flk-1，促红细胞生成素及其受体。缺氧预处理能诱导骨髓间充质干细胞表达促生存蛋白P105、NF-κB亚单位P65和P50，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。缺氧预处理的骨髓间充质干细胞移植到急性心肌梗死局部能减少移植细胞和心肌细胞的凋亡，促进更多的血管新生，缩小心肌梗死面积和改善心功能。

具体的，所述方法为：在细胞移植前，将将继代第3代的人骨髓间充质干细胞于37℃下在低糖DMEM培养基中缺氧培养20～30小时后，恢复37℃常氧培养2小时以上(通常培养24小时细胞较为稳定)，获得处理后的人骨髓间充质干细胞用于细胞移植。

具体的，所述缺氧培养为：在CO₂体积浓度5％、N₂体积浓度95％的混合气体中培养。所述常氧培养为：在CO₂体积浓度5％、O₂体积浓度95％的混合气体中培养。

具体的，所述方法如下：在细胞移植前，将人骨髓间充质干细胞于37℃下、在CO₂体积浓度5％、N₂体积浓度95％的混合气体中，于低糖DMEM培养基中缺氧培养24小时后，恢复37℃常氧培养24小时，获得处理后的人骨髓间充质干细胞再进行细胞移植。为提高人骨髓间充质干细胞旁分泌能力，该步骤操作可重复进行。

本发明的有益效果主要体现在：通过缺氧培养，可有效提高人骨髓间充质干细胞的旁分泌能力，能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，促红细胞生成素及其受体，进而提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。

(四)附图说明