[发明专利]甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于甘蔗水分胁迫相关的锌指蛋白基因序列。

背景技术

甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90％以上，同时甘蔗也是一种重要的能源植物。但我国甘蔗生产的立地条件差，旱地蔗面积占全国植蔗面积的85％以上，因此干旱是我国甘蔗生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，并严重影响甘蔗的产量和品质。克隆与表达甘蔗干旱胁迫相关的某些基因，已经成为当前研究热点之一。

干旱会导致植物失水而引发渗透势的变化，引起渗透胁迫。植物感受干旱后，胁迫信号经历一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达，在生理生化上作出调节反应。研究表明，转录因子在抗旱基因表达调控中起着重要的作用。其中锌指蛋白是一类在真核细胞中普遍存在，作为基因转录因子参与细胞内基因表达调控的核酸结合蛋白质，是真核细胞基因调控中起关键作用的一类调控因子。目前，人们已经从拟南芥、矮牵牛、水稻、大豆、棉花等植物中克隆了许多编码锌指蛋白的基因，并对其结构及功能进行了研究；利用转基因技术，也将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在目标植物中过量表达后，能对植物起到增强抗逆性的作用，说明锌指蛋白在增强植物逆境抗性方面有着广阔的应用前景。因此，克隆甘蔗水分胁迫相关的锌指蛋白基因将有利于研究甘蔗锌指蛋白基因在甘蔗抗旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，是通过以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因的CDS序列保守区设计简并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因的全长表达序列。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。

本发明的目的通过以下技术措施实现：

1、总RNA的提取

甘蔗茎节总RNA的提取采用Invitrogen公司的TRIzol试剂，试验步骤参照TRIzol试剂说明书。

2、cDNA第一链的合成

采用Invitrogen公司的SuperScript TM III反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链(方法见说明书)。

3、引物设计与引物合成

从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的水分胁迫相关锌指蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为256bp。引物设计后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

引物序列为：

ShZFP1F：5′-AGATGATAATGARGCAGGAGC-3′

ShZFP1R：5′-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC-3′

4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板，用简并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。

在此3’RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物作为模板，利用内侧引物和接头引物再进行PCR扩增。

基因外侧引物：5’-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3’

基因内侧引物：5’-ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3’

接头引物：5’-GGCCACGCGACTAGTAC-3’

在5’RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。

基因外侧引物：5’-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3’