[发明专利]一种糖化血红蛋白分离材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种新型糖化血红蛋白分离材料的制备方法，特别涉及含有弱阳离子交换基团的聚天冬氨酸有机质固定相的分离材料的制备。

背景技术

糖尿病是一种发病率很高的内分泌代谢疾病，主要标志是高血糖。血糖检测作为传统的糖尿病检测方法在临床上广泛应用。但是血糖浓度随进餐与否等外界条件波动性大，仅能反映检测时的血糖情况。糖化血红蛋白(Glycosylated Hemoglobin，GHb)是由葡萄糖在正常的血红蛋白的α链或β链上结合形成的特殊片段，其含量稳定，与血糖呈相关关系，能反映2-3个月内糖尿病病人体内血糖平均含量。糖化血红蛋白能直接代表糖尿病病人的血糖控制程度，对疾病的严重程度有指导作用，是目前作为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、疗效考核的有效检测指标，在临床检测中已得到广泛应用。

目前用于检测糖化血红蛋白的方法按照原理的不同主要分为三类：硼酸亲和层析法、免疫测定法和高效离子交换色谱法。其中高效离子交换色谱法是常用的蛋白质分离技术，该方法能够快速、方便的检测糖化血红蛋白，且检测结果可靠性高。

高效离子交换色谱法中所用固定相为阳离子固定相，它能检测血液中糖化血红蛋白，其作用机理为：用弱酸性阳离子交换树酯，在选定低浓度洗脱液的离子强度及PH条件下，由于血液中各组分蛋白所带电荷不同而分离。GHb几乎不带正电荷，首先被洗脱；正常血红蛋白带正电荷，再用高浓度洗脱液洗出血红蛋白，得到相应的层析谱，其横坐标是时间，纵坐标是百分比。GHb值是以GHb的部分面积在全血红蛋白面积的百分率来表示。

在快速高效的阳离子色谱柱发明以前，离子交换色谱法由于其检测糖化血红蛋白的操作复杂，耗时长，临床上难以广泛应用。早期固定相中应用最广泛的有机聚合物是纤维素或葡聚糖，它们含有羧甲基基团、容量高且亲水性好，但其机械强度差，不能忍受高压，检测糖化血红蛋白耗时长；为了提高检测速度，人们发明了表面键合聚天冬氨酸硅胶固定相，该固定相容量高，在低压下快速分离糖化血红蛋白，使糖化血红蛋白的检测时间大大缩短(Journal of Automatic Chemistry，1987，9(2)：92-96)，但硅胶表面活性基团数量有限，不能进一步提高改性硅胶的柱容量；且硅胶在一定程度上可使蛋白质变性，在碱性条件下易溶解，因此此固定相的应用受到了限制。

发明内容

本发明提出将聚天冬氨酸键合到改性树脂上，利用聚苯乙烯-二乙烯基苯有机高聚物为基球，制备糖化血红蛋白分离材料聚天冬氨酸聚苯乙烯-二乙烯基苯。该种糖化血红蛋白分离材料可以通过改变聚苯乙烯-二乙烯基苯基球的交联度，提高表面活性基团的表面覆盖率，从而提高柱容量；该材料不会使蛋白质变性，最大程度保证了检测结果的真实性；且克服了硅胶PH赖受范围小的缺点，使应用范围扩大。在达到上述目的同时，本发明不仅可以简化制备工艺，而且可以明显提高糖化血红蛋白分离的效果，延长使用寿命。

制备步骤是：

(1)表面氯甲基化的聚苯乙烯-二乙烯基苯基球的制备：

按照专利CN1412554A公开的表面附聚薄壳型高效阳离子色谱柱填料的制备方法制备交联度为10％-20％的1-10微米单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯，然后按照常规方法对其氯甲基化；

(2)表面氨甲基化基球的制备：

将(1)步制备的一定粒径的表面氯甲基化基球溶于含胺化试剂的有机溶剂中，并在30-50摄氏度下胺化8-14小时，水解得到表面氨甲基化的基球；

(3)聚琥珀酰亚胺的制备：

将天冬氨酸粉末溶解于无机酸中搅拌均匀后在干燥箱中于100-200摄氏度下反应4-15小时。用有机溶剂溶解此产物，趁热过滤，在快速搅拌条件下将滤液倒入蒸馏水或乙醚中，再次抽滤，将沉淀物自然干燥制备得到聚琥珀酰亚胺；

(4)聚琥珀酰亚胺聚苯乙烯-二乙烯基苯的制备：

将(2)步制备的表面氨甲基化基球和(3)步制备的聚琥珀酰亚胺溶解于有机溶剂中，于室温下搅拌10-24小时后抽滤，制得聚琥珀酰亚胺聚苯乙烯-二乙烯基苯。

(5)聚天冬氨酸聚苯乙烯-二乙烯基苯的制备：

将(4)步制备的聚琥珀酰亚胺聚苯乙烯-二乙烯基苯在含胺化试剂的水溶液中于室温摄氏度下搅拌10-24小时抽滤，得到聚天冬氨酸聚苯乙烯-二乙烯基苯。

(2)中所述的胺化试剂可为邻苯二甲酰亚胺或六次甲基四胺，有机溶剂可为氯仿或二氯乙烷；(3)中所述的无机酸可为磷酸或硫酸或硝酸或硼酸；(3)和(4)中所述的有机溶剂可为N，N-二甲基甲酰胺或甲苯或四氢呋喃；(5)中所述的胺化试剂可为甲胺或乙胺或丙胺或二甲胺或二乙胺或二丙胺或三乙胺。