[发明专利]苯酚降解调控基因及其作用的启动子

说明书

技术领域：

本发明涉及苯酚降解调控基因及其作用的启动子。具体涉及一种苯酚降解调控蛋白的核苷酸编码序列和其作用的苯酚羟化酶启动子的核苷酸编码序列。本发明还涉及所述两个核苷酸编码序列在苯酚生物降解和酚类污染物的生物治理和监控中的应用。

背景技术：

苯酚等酚类化合物常发现于工业污水中，给环境造成巨大的直接和潜在危害。

生物降解是非常环保的处理苯酚等污染物的技术。中国专利021488142《苯酚羟化酶基因及其用途》筛选分离到有降解苯酚能力的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)PHEA-2。该菌株能将苯酚转化为邻苯二酚，邻苯二酚进一步开环裂解可以转化成CO₂和H₂O，完全消除了废水中苯酚的污染。该专利还公开了构建菌株基因文库的方法，克隆了将苯酚转化为邻苯二酚的苯酚羟化酶(phenol hydroxylase)的编码基因。将该基因转入醋酸钙不动杆菌PHEA-2中，可以增强原菌降解苯酚的能力；转入甲苯降解菌Psudomonas sp.A5中可以使重组菌获得原菌不具备的苯酚降解能力。

总之，专利021488142的研究重点是苯酚降解功能基因(结构基因)的克隆，未涉及苯酚降解调控基因的克隆和调控机制的研究。

生物降解调控系统的研究非常重要，它对于深入探讨重要生命现象的内在本质，阐述细胞降解行为的分子机理，揭示降解过程中基因表达的时间和空间特异性及其网络体系，均具有重要意义。

自然环境中某些微生物可以降解苯酚污染物是因为生物体内具有遗传基因编码的相应降解酶。降解酶的表达一般受到调控蛋白的调控，当细胞生活在苯酚富集的生境时，调控蛋白识别苯酚分子信号并开启降解酶的表达，使细胞可以利用苯酚作为碳源生长，同时苯酚被转化成对环境无害的物质。目前发现的苯酚降解调控蛋白都属于NtrC/XylR型调控蛋白家族，这类调控蛋白作用的启动子是依赖σ⁵⁴ RNA聚合酶的启动子，被称为σ⁵⁴型启动子(Eduardo Díaz and María A Prieto，2000)。σ54型启动子具有-24(TGGC)/-12(TTGC)保守碱基，因此又被称为-24/-12启动子。(Eduardo Diaz and María A Prieto，2000)。NtrC/Xy1R型调控蛋白结合于σ⁵⁴型启动子上游两个反向重复序列(IR)组成的上游激活序列(UAS)启动σ⁵⁴型启动子的表达。

发明内容：

本发明的目的是得到一种苯酚降解调控蛋白的核苷酸编码序列和其作用的苯酚羟化酶启动子的核苷酸编码序列。

本发明的进一步目的是将所述两个核苷酸编码序列用于苯酚生物降解和酚类污染物的生物治理和监控。

本发明发现并克隆了苯酚降解调控基因，命名为mphR。该基因的DNA序列如SEQID NO：1所示。该DNA序列编码的苯酚降解调控蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO：3所示。

所述苯酚降解调控基因mphR发现于醋酸钙不动杆菌PHEA-2的苯酚羟化酶基因的上游。通过反向PCR方法克隆到苯酚羟化酶上游的约3kb片段。核苷酸序列测定结果表明，SEQ ID NO：1序列中包含了一段长1671bp的阅读框，编码全长为556个氨基酸的SEQ ID NO：3序列。经序列比较分析(见图1)，显示该蛋白属于NtrC/Xy1R调控蛋白家族。当醋酸钙不动杆菌PHEA-2中SEQ ID NO：1序列缺失突变后，该菌株失去降解苯酚和激活苯酚羟化酶启动子表达的能力。

本发明还发现了所述苯酚降解调控基因mphR作用的苯酚羟化酶启动子，其序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明进一步发现：在SEQ ID NO：2序列中，170～230位是启动子上的上游激活序列(UAS)。实验证实：当170到230位碱基缺失后，调控蛋白不能结合于SEQ ID NO：2序列上，使得SEQ ID NO：2序列失去启动子的功能。

因此，本发明还确定了SEQ ID NO：3蛋白与SEQ ID NO：2序列有功能的结合位点是SEQ ID NO：2的170～230位的两个反向重复序列上。