[发明专利]膜联蛋白A2的血清检测方法、检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体而言，涉及单独使用新的标志物检测HCC或者与AFP联用使用检测HCC的方法、检测试剂盒及其应用。

背景技术

肝癌(Liver cancer)是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，2000年全世界新发病例约564,000人，在所有恶性肿瘤中排第五位。由于其恶性程度高、预后不良，五年生存率不足10％。中国是肝癌的高发区，集中了全世界约54％的新发病例，其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinomas，HCC)占原发性肝癌的90％以上^[1，2]。据1991-2000年间，中国169,871人口的死因抽样调查显示，它的死亡率排在全部恶性肿瘤的第2位，年死亡率为54.7/100,000(男81.2，女29.0)^[3]。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是目前临床上公认的HCC诊断标志物。20世纪50年代，Bergstrand等人首次在人类胎儿血清中发现了这种电泳迁移率相当于甲种球蛋白的蛋白质，在正常成人血清中并没有检测到它的存在^[4]。1960年，Abelev G及其同事在小鼠的肝细胞癌中发现了这种甲种球蛋白，它不存在于正常小鼠的任何组织中，经证实它是胎鼠血清中的主要成分，在成年鼠肝细胞再生时会重新出现^[5]。后来，HCC患者和畸胎瘤患者血清中胚胎特异性的甲种球蛋白也被检测出来^[6，7]。因此，人们将这种主要存在于胎儿组织的蛋白命名为甲胎蛋白。

目前已知，AFP是一种分泌型糖蛋白，与白蛋白同属于白蛋白样基因家族。它主要存在于啮齿类动物和人胚胎期血清中，由胚胎发育时期卵黄囊内胚层和胎肝合成并分泌到血液中。在人类胚胎中AFP最高浓度可达3-4mg/ml，出生后，血清中AFP浓度迅速下降，新生儿期约为10-50μg/ml，正常成人一般在10ng/ml以下。怀孕期间母体血清中AFP浓度的变化可以提示多种胚胎发育缺陷^[8]。而成人中，升高的血清AFP水平不仅存在于60％-70％的HCC病人，也可见于大约20％的慢性肝炎，20％-60％的肝炎肝硬化和某些胚胎性癌患者^[9]。在有慢性肝炎和肝硬化背景的HCC患者中，AFP的诊断价值更低^[10，11]。因此，AFP对于HCC患者的诊断灵敏度介于41％-97％之间，特异度在80％-95％，而阳性预测值徘徊在9％-58％之间^[10-12]。更为重要的是，临床上有20％-30％的HCC患者血清AFP水平并不升高，从而大大限制了其在HCC临床检查中的应用价值。因此，目前迫切需要找到能与AFP联合使用，提高HCC诊断准确度的新标志物。

综上所述，由于目前尚缺乏有效的肝癌检测方法，因此，本领域迫切需要开发建立新的肝癌患者血清ELISA检测方法和可以方便快捷检测的试剂盒。

为此，本发明人进行了大量的研发工作，在前期工作中，发明人提取了三个肝癌细胞系HepG2、Hep3B和SK-HEP-1，及一个正常肝细胞系HL-7702的亚细胞组分，并经双向电泳分离(2-DE)，选取具有三倍以上差异的蛋白质点，胶内酶解后经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定。在胞浆组分中，发明人意外地发现了一个在AFP阴性肝癌细胞系SK-HEP-1中特异性高表达的蛋白质点，经质谱鉴定为膜联蛋白2(Annexin A2，ANXA2)。