[发明专利]毛白杨的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说是涉及毛白杨的遗传转化方法。

背景技术

杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一。杨树具有速生优质，轮伐期短，适应性强，繁殖容易，用途广泛等特点。杨树是世界上许多国家和我国重要的造林绿化树种，也是生态防护林的主要树种。它还是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要工业原料(张绮纹等1999)。与其它林木相比，杨树生长快。易于无性繁殖，遗传转化容易，已构建较饱和的各种连锁图，获得大量与目标性状相关的分子标记。最近，由美国橡树岭国家实验室和能源部联合基因组研究所完成了毛果杨全基因组测序草图，发现在19条染色体上有4万5千个基因(Tuskan等2006)。杨树的这些特点，使其成为研究多年生植物重要的模式植物(Brunner等2004)。

毛白杨是我国特有的乡土树种，遍布于我国黄淮海流域100多万平方公里的10多个省、市、自治区。毛白杨生长迅速，适应性强，纤维较长，材质优良、树干高大通直，树形美观，是民用、建筑、家具用材和纤维工业的重要原料，也是杨属中最适于作为纸浆材原料的优良树种之一(李科友，樊军锋，赵忠，李玲.中国农学通报，2007，23：171-175)。但是由于生长周期长、树体高大，异花授粉和杂交不亲和性等原因，极大地限制了杨树传统育种工作的开展。植物基因工程的兴起，为毛白杨遗传改良提供了新的途径。通过植物遗传转化将外源基因引入到植物细胞并使其稳定地遗传和表达，从而获得新的生物学性状，开辟了毛白杨育种的新途径(何承忠，张志毅，安新民，李善文.西南林学院学报，2006，28：86-89)。

毛白杨遗传转化的研究是基因工程育种的基础，前人已经进行了一些研究，建立了毛白杨遗传转化体系(王善平，许智宏，卫志明.植物学报，1990，32(3)：172-177；卜学贤，林忠平，陈维伦.植物学报，1991，33：206-213；郑均宝，张玉满，杨文芝.河北农业大学学报，1999，3：20-25；郝贵霞，朱祯，朱之悌.植物学报，1999，41：936-940；Yang CL，Zu GC，Zhao SM.Dev Biol，2001，10：61-68；李科友，樊军锋，赵忠，李玲2007，中国农学通报，7：171～175)。但是上述的研究成果只能将单一的转化子(既包含外源基因的植物表达载体)导入到毛白杨中。由于植物的多数性状如产量、品质等是由多基因控制，仅靠改变其中的某一基因很难达到改良性状的目的，所以多基因转化策略是植物遗传改良研究的主要方向(李宝健和朱华晨，2005，中山大学学报，4：79～83)。二次转化(retransformation)可以实现两个或多个外源基因导入受体植物中，是进行遗传改良和功能基因研究的有效手段(Halpin，2005，PlantBiotechnol J，3：141-155)。目前已经在烟草、马铃薯、拟南芥、连翘等植物的遗传改良中得到应用(Halpin，2005，Plant Biotechnol J，3：141-155)。Qi等(2004)采用二次转化手段将负责合成长链不饱和脂肪酸的三个基因转化到拟南芥中，获得了富含0mega-3和0mega-6的转基因植物。采用二次转化方法将两个乙二醛酶基因导入到烟草中，获得了比转化单个乙二醛酶基因具有更高抗盐特性的转基因植物(Singla-pareek等2003)。但是由于所采用的质粒不同，抗生素的筛选等各种因素都不一样，无法将这种二次转化方法直接应用到毛白杨中；现有的毛白杨一次转化方法也无法直接推导得到毛白杨的二次遗传转化方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的毛白杨的遗传转化方法，以实现多基因导入毛白杨，为林木遗传改良提供一个新的途径。

本发明的目的是这样实现的：一种毛白杨的遗传转化方法，其特征在于：采用农杆菌介导的方法对毛白杨进行两次遗传转化，导入两个外源基因；其中一次转化采用包含有新霉素磷酸转移酶基因NptII(即卡拉霉素抗性基因)和β-葡糖醛酸糖酶基因(即可以进行GUS组织染色)的植物双元表达载体，并且以卡拉霉素作为抗生素；二次转化采用包含有潮霉素磷酸转移酶基因(即潮霉素抗性基因)的植物双元表达载体，并且以潮霉素作为抗生素；上述的植物双元表达载体均可按常规分子克隆方法获得。

其中上述一次转化所用的植物双元表达载体优选为p5-GhGA20ox1质粒、pCAMBIA质粒或pZIP质粒；所述二次转化所用的植物双元表达载体优选为p5-GhDET2-Hpt质粒或pCAMBIA1301质粒。