[发明专利]冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及中药冬虫夏草有效成分含量的测定方法，特别涉及一种利用固相萃取结合HPLC测定冬虫夏草中多球壳菌素含量的方法。

背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是一种名贵中药，在真菌分类学中，冬虫夏草隶属于子囊菌纲(Ascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps sp.)。虫草的种类在世界范围内数以百计，我国作为药用的虫草主要有冬虫夏草、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)和蝉花(Cordyceps cicadae)等，尤以冬虫夏草最为著名。冬虫夏草具有益精髓、补虚损、保肺、益肾等功效，主要用于虚劳咳嗽、咯血盗汗、阳痿遗精、腰膝酸软等症。现代药理研究表明冬虫夏草具有治疗慢性支气管炎、治疗慢性肾炎、镇静催眠、雄激素样等作用，还具有抗癌活性以及免疫调节等作用。

多球壳菌素是存在于冬虫夏草中的一种有效成分。药理研究表明，多球壳菌素具备多种药理作用，如：多球壳菌素具有显著的双向免疫调节作用，特别是具有独特的免疫抑制作用，能阻断白介素-2受体以下的信号传导途径，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶活性，从而特异性抑制T细胞的增殖；多球壳菌素对同种细胞障碍性T细胞的诱导均有很强的抑制活性，在这些方面比环孢菌素A强10～100倍；在同种混合淋巴球混合反应方面，多球壳菌素也比临床广泛应用的环孢菌素A显示更强的活性。

除了从蝉花发酵滤液及菌丝体中分离得到多球壳菌素外，Fujita等从无孢菌(Mecelia sterillia)、多球菌(Myriococcum albomyces)及木霉多孢菌(Trichoderma polysporum)等微生物中分离得到多球壳菌素。我们在冬虫夏草及其无性型中国被毛孢(Hirsutella sinensis)菌丝体中发现含有多球壳菌素。基于多球壳菌素的药理价值及冬虫夏草广泛的临床应用，建立简便易行的冬虫夏草中多球壳菌素的HPLC测定方法对于合理评价冬虫夏草的价值，有效利用冬虫夏草资源，控制人工冬虫夏草药材质量，以及开发多球壳菌素均具有重要意义。

目前国内外尚未见定量分析多球壳菌素方法的文献报道，也未见分析冬虫夏草或中国被毛孢菌丝体中多球壳菌素含量的报道。多球壳菌素经紫外吸收光谱测定，为末端吸收，随着波长变长噪音变小，但灵敏度下降，响应值变低，因而检测波长需选择在紫外末端；冬虫夏草中多球壳菌素含量较低，化学成分复杂，含有大量糖、肽、氨基酸等物质，杂质干扰严重；冬虫夏草的溶剂提取物色泽深、粘度大。这些因素均显著影响冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定，冬虫夏草溶剂提取物需经分离纯化方可用于HPLC分析。

发明内容

本发明提供了一种简便、灵敏、重现性好的固相萃取结合高效液相色谱定量测定冬虫夏草中多球壳菌素的方法。采用的技术方案如下：

一种冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

精密称取多球壳菌素对照品，加甲醇制成0.001～1.0mg/mL的多球壳菌素对照品溶液备用；

(2)标准曲线的制作

取多球壳菌素对照品溶液适量，分别精密吸取1、10、20、40、50μL注入高效液相色谱仪；采用色谱柱：C18色谱柱，流动相：乙腈与水体积比20～80∶80～20，流速0.6～1.2mL/min，柱温20～65℃，检测波长190～215nm；测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(3)供试品溶液的制备

提取：取冬虫夏草样品，经粉碎，通过20～200目的分样筛，然后精密称取0.1～5g置入容器中，加10～250mL溶剂提取，随后移出上清液，同法提取1～3次，得总提取液；其中所述冬虫夏草样品的提取溶剂为甲醇、乙醇、水的一种或它们的混合溶剂；所述提取方法采用超声提取法、加热回流提取法、浸泡提取法的一种；

过固相萃取柱：定量移取总提取液在常压或减压下挥干后用浓度小于50％的甲醇溶液或水1～10mL溶解，离心，取上清液作上样液；将上样液加到十八烷基固相萃取柱上，待上样液通过十八烷基固相萃取柱后，第一次用浓度小于50％的甲醇溶液或水冲洗，冲洗液弃之；随后第二次用60％～100％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；其中所述十八烷基固相萃取柱上样前先用甲醇活化和蒸馏水平衡；

供试品定容：收集含有多球壳菌素的洗脱液在常压或减压下挥干，向挥干后的残留物加入甲醇溶解，甲醇溶解液离心，取上清液即得供试品溶液；或甲醇溶解液用微孔滤膜过滤，取续滤液得供试品溶液；