[发明专利]一种南瓜花叶病毒长期保存方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种植物病毒的保存方法，具体涉及一种南瓜花叶病毒的长期保存方法。

(二)背景技术

由南瓜花叶病毒(SqMV)侵染引起的南瓜病毒病是南瓜生产中的主要病害，在进行诸如病害发病规律及防治研究中的首要条件是如何保存毒源的活性。作为一种植物病毒病害，其毒源是一种专性寄生物，其不象真菌和细菌能够利用培养基分离培养并利用斜面培养基保存。因为病毒只能在活体植物上保存，而且需要经常性转接到植物上，非常繁琐，而且活性降低。因而寻求如何进行南瓜花叶病毒(SqMV)长期保存的方法为南瓜花叶病毒的一系列研究奠定基础。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种可避免盲目增加活化病毒的次数，减少人力物力的浪费，又可使原毒种保持其活性，减少变异和污染的南瓜花叶病毒长期保存方法。

本发明的目的是这样实现的：首先将待保存的毒源置于防虫温室内进行隔离活化繁殖，待发病后，取中位重病叶按1∶5的比例加入0.02M pH7.0磷酸缓冲液(PBS)于研钵中研磨，研成浆糊状，四层纱布过滤，去滤渣，滤液经4000rpm离心30min，去渣，上清液装入玻璃管，按病毒粗提液体积加入0.8％谷氨酰胺酸钠、2％葡萄糖和2％丙三醇，冷冻干燥后密封保存。

本发明还有这样一些技术特征：

1、所述的在防虫温室内进行隔离活化繁殖步骤为：实验用具和栽培土均经高压热力消毒，取高感SqMV的南瓜种子催芽后播种，待南瓜苗长到3-4片真叶时，称取5g保存的毒源叶片放入研钵中，同时加入25ml 0.02M pH7.0磷酸缓冲液(PBS)进行研磨，将叶片研磨成浆糊状，采用摩擦接种法接种后放入防虫温室(白天20℃，晚上10℃)中待其发病；

2、所述的0.02M pH7.0PBS缓冲液为磷酸缓冲液，按照(叶片∶缓冲液＝1∶5)比例加入缓冲液(1克毒源叶片加入5毫升的磷酸缓冲液)，利用研钵研磨，将叶片研成浆糊状即可。

本发明是一种研究南瓜病毒病主要毒源长期保存效果的方法，本发明提供了一种探索南瓜花叶病毒保持年限及最佳途径，可避免盲目增加活化病毒的次数，减少人力物力的浪费，又可使原毒种保持其活性，减少变异和污染。

本发明的实验效果为：

分别取加入保护剂在-26℃冰箱保存1年、2年、3年、4年的病毒粗提液及未加保护剂在-26℃冰箱保存1年、2年、3年、4年的病毒粗提液接种到南瓜感病品种中，根据植株的犯病率测定病毒的活性，结果加入保护剂在-26℃冰箱保存1年、2年、3年、4年的病毒粗提液接种到南瓜感病品种的发病率分别为100％、100％、100％、83.3％。未加保护剂在-26℃冰箱保存1年、2年、3年、4年的病毒粗提液接种到南瓜感病品种发病率分别为50％、25％、0％、0％。结果表明：按病毒粗提液体积加入0.8％谷氨酰胺酸钠、2％葡萄糖、2％丙三醇等保护剂，冷冻干燥后密封后放入-26℃保存这种方法保存4年病毒的感染率仍达到83.3％。而将病毒粗提液直接放入-26℃保存1年病毒的感染率只能达到50％，保存2年病毒的感染率仅为25％。

表1不同保存方法下的显症率

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

本实施例中首先将待保存的毒源置于防虫温室内进行隔离活化繁殖，在防虫温室内进行隔离活化繁殖，具体步骤：实验用具和栽培土均经高压热力消毒，取高感SqMV的南瓜种子催芽后播种，待南瓜苗长到3-4片真叶时，称取5g保存的毒源叶片放入研钵中，同时加入25ml0.02M磷酸缓冲液(pH7.0)进行研磨，将叶片研磨成浆糊状。采用摩擦接种法接种后放入防虫温室(白天20℃，晚上10℃)中待其发病。

待发病后，取中位重病叶加入0.02M PBS缓冲液研磨，0.02M PBS缓冲液(pH7.0)为磷酸缓冲液，按照1∶5的比例加入缓冲液(1克毒源叶片加入5毫升的磷酸缓冲液)，利用研钵研磨，将叶片研成浆糊状即可。四层纱布过滤，去滤渣，滤液经4000rpm离心30min，去渣，上清液装入玻璃管，按病毒粗提液体积加入0.8％谷氨酰胺酸钠、2％葡萄糖和2％丙三醇，冷冻干燥后密封保存。