[发明专利]一种混合模式扩张吸附床介质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种混合模式扩张床吸附介质及其制备方法，以巯基苯并咪唑和砜基为配基，属于层析分离中扩张床吸附分离蛋白质技术。

背景技术

抗体是一种重要的生物技术产品，广泛用于免疫治疗、疾病预防和医学诊断。近年来针对抗体的分离技术取得了一定的进展，但是还需要不断的补充和完善。

常规的离子交换层析和疏水相互作用层析能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，影响抗体的活性收率。Protein A亲和层析介质能够选择性吸附抗体，但是介质价格昂贵，且配基易被料液中蛋白酶降解，重复使用次数低，操作成本极高，限制其大规模应用。混合模式层析(Mixed-modechromatography)是近年来发展的一种新型生化分离技术，结合两种以及两种以上的配基—蛋白质相互作用模式，可以显著提高吸附容量和吸附选择性，其中耐盐性亲硫层析是一个重要方向。自1985年Porath(Porath et al.FEBS letters，1985，185：306)等首次应用亲硫层析(thiophilic chromatography)从血清中分离出抗体以来，亲硫层析在蛋白质纯化方面，特别是抗体纯化方面有了诸多应用。亲硫配基中砜基的硫是个缺电子区，可作为电子受体，而临近的硫醚中的硫则为电子富集区，作为电子供体。该特殊结构可以对抗体分子保守区的一些电子供体-受体位点产生特异性作用，提高抗体吸附的选择性。然而，传统亲硫层析必须在一定浓度的硫酸铵或硫酸钠下才能进行有效吸附抗体，不利于抗体分离，限制其规模化应用，寻找新型的、耐盐的亲硫性混合模式配基是发展趋势。

扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption，EBA)技术形成于20世纪90年代，是一种集固液分离、浓缩和初期纯化于一个操作单元之中的新型蛋白质分离纯化技术。EBA能直接从细胞液、细胞匀浆液或者组织提取液中捕获目标产物，减少了操作单元数，缩短了处理时间，节约了生产成本，是近十几年来出现的一个新的单元操作。因此，本发明以纤维素/无机增重剂复合微球为扩张床吸附基质，经二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶联后的巯基苯并咪唑作为其主要功能配基，形成了一种新型亲硫性混合模式扩张吸附床介质，可用于大规模扩张床吸附分离抗体，成为一种高效集成化的新型抗体分离工艺，相关研究未见文献报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床吸附介质及其制备方法。

以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床吸附介质：介质的组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶联后的巯基苯并咪唑，结构组成为：

所述的纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不锈钢粉、镍粉或碳化钨粉，增重剂占湿球的质量百分比含量为16％～61％；纤维素/无机增重剂复合微球的粒径为50～250μm。配基为2-巯基-1-R-苯并咪唑，R为0-2个碳原子的短链烷烃。配基密度为28～58μmol/ml介质。

混合模式扩张床吸附介质的制备方法：首先将纤维素粘胶和无机增重剂充分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16％～61％，加入5倍纤维素粘胶质量的泵油，控制转速500～800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，筛选50～250μm粒径的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/无机增重剂复合微球、二乙烯基砜、0.1～0.5M pH12的碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜混合，二乙烯基砜添加的体积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的18％～36％，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3倍双键摩尔量的巯基乙基吡啶和含25mg/ml过硫酸铵的0.2～0.7M氢氧化钠溶液混合，60℃下180rpm摇床中偶联8h；最后将微球加入到含有1％H₂O₂和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床吸附介质。反应过程示意图为：

本发明充分结合了疏水相互作用、电荷诱导作用和亲硫作用等多种配基—蛋白质相互作用原理，形成特殊的混合模式吸附，具有吸附容量大、选择性高等优点。同时，新型混合模式计配基偶联到纤维素/无机增重剂复合扩张床基质上，形成了新型的扩张床吸附介质，可以用于抗体等蛋白质的规模化、高效分离纯化。

附图说明

图1混合模式介质吸附卵黄抗体的静态吸附等温线(不同pH)；

图2混合模式介质吸附卵黄抗体的静态吸附等温线(不同盐浓度，pH＝7)。